大菱鲆源鳗弧菌的分离鉴定及药敏分析

■ 栾林林 张永刚 王凤军 任 媛 任 海 李 强 靳晓敏*

（1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023；2.淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港222002；3.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北昌黎066600）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）音译名“多宝鱼”，俗称欧洲比目鱼[1]，因其具有较高的经济效益，目前已成为我国海水养殖鱼类产量最大的品种[2]。随着大菱鲆养殖规模和产量逐年扩大，及高密度工厂化养殖技术的推广，在养殖过程中其细菌性疾病频发。国内外相关报道，目前细菌性疾病的主要病原以弧菌为主，包括鳗弧菌（V.anguillarum）、哈维弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、杀鲑弧菌（V.salmonicida）、灿烂弧菌（V.splendidus）等[3-4]。

2017年5月，河北昌黎某养殖场大菱鲆发生病害并伴有死亡，主要症状为鳃盖、体表有出血点，腹腔膨胀有积液，肝脏、脾脏充血或出血，肠道内有淡黄色黏液。笔者从患病大菱鲆肝脏中分离获得一株优势菌DLP-1，对其进行人工感染试验。攻毒试验显示大菱鲆死亡率高达85%，并从肝脏中分离到该菌，证明其为此次发病的病原菌。并通过对该菌的主要理化性状及16S rRNA基因序列鉴定，结合构建系统发育树表明，该病原菌为鳗弧菌（Vibrio anguillarum）。同时对该菌的药物敏感性进行检测。旨在明确其病原菌及敏感药物，为大菱鲆健康养殖及疾病防治提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 病鱼来源

患病及濒死大菱鲆均取自河北昌黎某大菱鲆养殖场，体长约25 cm，体重400～500 g。试验用健康大菱鲆取自河北昌黎另一大菱鲆养殖场，规格相似，于水温18～19℃条件下暂养7 d。

1.2 试验试剂

ATB自动鉴定系统及ID32E细菌鉴定试剂条购于法国梅里埃生物公司；TianGen细菌基因组DNA提取试剂盒及引物均购于上海生工生物工程股份有限公司；普通营养琼脂购于北京陆桥生物技术有限责任公司；药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司；五倍子等24种中草药均购于河北昌黎百草堂大药房。

1.3 病原体的分离鉴定

在无菌情况下，用接种环取患病大菱鲆肝脏等组织接种于普通营养琼脂，28℃倒置培养24～48 h，根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等形态学特征对细菌进行分离纯化。将纯化后的菌株置于20%甘油的保种液中，-80℃冰箱保存。

挑取纯化培养的单菌落，用灭菌生理盐水稀释后进行涂片革兰氏染色，用显微镜观察细菌形态，拍照。吸取40 μl菌悬液加入ID32E生化鉴定试纸条的各孔中，在需厌氧培养的孔中加入矿物油，置于湿盒，28℃培养12～24 h；次日在吲哚试验孔加入1滴James，将试纸条置于ATB自动鉴定系统中进行鉴定。

在无菌条件下接种纯培养菌于5 ml营养肉汤中，28℃110 r/min振荡培养16 h。采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行细菌DNA的提取。利用细菌16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′)对细菌总DNA的相应序列进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后进行测序。将测得16S rRNA基因序列与NCBI数据库核酸序列进行BLAST比对分析，并构建系统发育树，结合其理化特性对菌种进行归类判定。

1.4 动物回归感染试验

选取体色正常、活力旺盛的大菱鲆个体分为试验组和对照组，每组10尾，均设置3个平行。将分离菌接种到肉汤培养基中摇菌，28℃培养过夜，取1 ml菌液于1.5 ml离心管，3 000 r/min离心2 min，弃去上清液，制成菌悬液。参考沈萍等[5]的方法，将菌悬液浓度调为5.0×108CFU/ml。采用腹腔注射法进行攻毒试验，每尾注射0.2 ml。对照组大菱鲆注射等量无菌生理盐水。试验周期为7 d，间隔6 h观察大菱鲆有无异常情况，并记录试验鱼发病及死亡情况。

如人工感染的试验鱼症状与自然发病鱼相同或相似，则再次细菌分离鉴定，以明确病原菌。如经人工感染后发病症状与原症状不同则排除初次分离菌。

1.5 病原菌的药敏试验

采用纸片扩散法（K-B法）。用灭菌棉签蘸取稀释后的菌悬液，均匀涂布于营养琼脂平板表面，将氟苯尼考等22种药敏纸片贴于平板表面，每个培养皿贴6片，28℃培养24 h，观察抑菌圈情况，用直尺测量抑菌圈直径。药敏结果判定标准参考NCCLS手册2017版。

参考张永刚等[6]的方法制备中草药液，并在其基础上略加改进。将得到的中草药液经高压灭菌121℃15 min后，置于4℃冰箱冷藏备用。采用牛津杯打孔法，对五倍子等24种中草药进行药敏试验。用灭菌棉签蘸取菌悬液，均匀涂布于普通营养琼脂打孔培养基上，每孔各加入180 μl各中草药原液，28℃培养24 h后查看结果，每种中草药3个平行。判定标准参考叶应妩[7]编写的《全国临床检验操作规程》，抑菌圈直径≥20 mm判定为高度敏感(S)、10～19 mm为敏感(I)、小于10 mm的为耐药(R)、无抑菌圈形成(记作 0)。

采用96孔酶标板，微量二倍稀释法测定MIC和MBC[8]。

2 结果

2.1 细菌培养特性

在普通营养琼脂平板接种纯化病原菌，28℃培养24 h，DLP-1为圆形光滑、边缘整齐、较隆起不透明、淡黄色菌落，直径约0.8～1.0 mm（图1）。革兰染色为阴性、两端钝圆的短杆状，有的菌体弯曲呈弧形（图2）。

图1 菌株DLP-1培养形态

图2 菌株DLP-1革兰氏染色（H.E.，100×）

2.2 菌株DLP-1生理生化特性

从表1可知，d-葡萄糖、过氧化氢酶、吲哚及赖氨酸脱羧酶阳性；精氨酸双水解酶、硫化氢阴性；参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌学鉴定手册》中弧菌属的特征，对菌株DLP-1进行分类地位的鉴定，初步鉴定筛选菌株属于弧菌科。

表1 菌株DLP-1的生理生化特性

2.3 16S rRNA基因序列测定结果及菌种判定

采用通用引物对菌株DLP-1的16S rRNA PCR扩增产物进行序列测定，使用Blast软件对所获得测序结果在NCBI数据库进行序列相似性比对分析，系统发育树如图3所示。结果表明，本研究分离获得的菌株DLP-1属于弧菌科弧菌属(Vibrio)，与鳗弧菌(Vibrio anguillarumDSM 21597 CP010084)的相似性为99%。

2.4 人工感染试验结果

试验组鱼在感染后第2 d活力减弱，体表背侧出现红色疮口、尾鳍末端溃烂，腹部膨胀、局部有溃烂灶、鳃糜烂。解剖可见腹腔充满积液，肠内充满淡黄色黏液，胆囊发黑、肝脏苍白，与自然发病鱼症状相同。取濒死鱼血液、肝、脾接于普通营养平板上分离纯化，经鉴定与分离菌株特性相同，通过16S rRNA基因序列分析鉴定为鳗弧菌，对照组鱼正常。

2.5 药物的敏感性测定

图3 基于16S rRNA基因序列的菌株DLP-1系统发育树

2.5.1 西药敏感性结果(见表2)

由表2可知，氟苯尼考、庆大霉素和他唑巴坦等11种药物对鳗弧菌的抑菌作用最明显，抑菌圈直径最大，为理想的抑菌药物；对四环素、氨苄西林及克林霉素等11种药物耐药。

2.5.2 中草药敏感性结果（见表3、表4）

表2 22种药物对鳗弧菌的抑菌效果

表3 24种中草药对鳗弧菌的抑菌效果

由表3可见：五倍子、菌陈、黄岑、乌梅及赤芍五种中草药对鳗弧菌的抑菌作用最明显，抑菌圈直径最大，为理想的抑菌药物；对栀子、连翘等10种中草药敏感；对车前子、白头翁及益母草等9种中草药耐药。

表4 优选中草药对鳗弧菌的MIC和MBC的影响

由表4可见，在优选中草药中，五倍子抑菌、杀菌效果最强，MIC为1.512 5 mg/ml、MBC 12.5 mg/ml，乌梅、黄岑、连翘及栀子抑菌、杀菌效果较强，而赤芍及菌陈抑菌效果最弱，MIC均为50 mg/ml，且未检测出其MBC。

3 讨论

本试验挑选常用中草药24种、西药22种，以患病大菱鲆分离得到的鳗弧菌DLP-1为供试菌，进行抑菌药物的筛选。结果表明，DLP-1对氟苯尼考、头孢唑啉、庆大霉素等药物高敏，抑菌圈直径均在20 mm以上。张昕等[9]用8种常用抗生素药物对四种海洋致病弧菌进行药物敏感性测试，结果表明鳗弧菌对氯霉素、庆大霉素具有敏感性，但对卡那霉素、青霉素等其他所测药物均表现出耐药性。本试验抑菌效果与其相似，但鳗弧菌对抗生素的敏感性有差异，可能不同地区大菱鲆患鳗弧菌后使用的药物不同从而导致敏感性不同，也可能由于不同地区菌株有所差异导致结果不同。

在中草药抑菌试验中，DLP-1对五倍子、赤芍、菌陈、乌梅、黄岑高敏，其中五倍子抑菌、杀菌效果最佳，MIC为1.512 5 mg/ml，MBC为12.5 mg/ml。梁利国等[10]用4种常用中草药对病原弧菌（鳗弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、河口弧菌）体外抗菌效果作出了研究，其中苏木、五倍子、地锦草、石榴皮4种中草药具有较好的抑菌和杀菌作用，MIC和MBC分别为1.56～3.12 mg/ml和3.12～6.25 mg/ml；张明等[11]用20种中药对鳗弧菌抑菌杀菌作用研究发现，黄芩、五倍子、石榴皮等5种中药对鳗弧菌的抑菌作用效果显著，MIC和MBC分别为3.125 mg/ml和6.25 mg/ml。本试验抑菌效果与其相似，但抑菌浓度却是其10倍以上。可能是不同菌株间对药物的敏感性有差异，这点从梁利国等对四种弧菌的测定结果可以证实；也可能由于试验方法及药物的熬制方法不同，导致结果有所差异。但本试验只进行了中草药的体外抗菌试验，其结果可作为中草药防治鳗弧菌感染的依据，在实际生产中的应用效果有待进一步验证。