固态发酵木薯酒精渣生产生物饲料的研究

■ 李 洁 李 昆 张孟阳 王德培，4*

(1.工业微生物教育部重点实验室，天津300457；2.中粮（北京）饲料科技有限公司，北京102209；3.天津科技大学生物工程学院，天津300457；4.省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津300457）

木薯酒精渣是全木薯发酵制取酒精后的副产物，水分含量高达85%而且酸度大，并含大量粗纤维和粗灰分，无法在常温下保存，极易腐败变质造成环境污染，即使作为饲料进行饲喂，适口性比较差，动物难以消化吸收，成为木薯全渣发酵酒精的主要固废物，是生产企业无法处理的固废污染难题。以木薯酒精渣为主要原料进行发酵饲料研制，人为控制的条件下，以工业副产物木薯渣为主要原料，以玉米淀粉渣、玉米皮、湿法糖渣等工业副产品作为碳源和氮源的补充料，添加碳酸钙等作为缓冲剂，通过枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等微生物自身的生长代谢作用，改变木薯渣的物理、化学性质。具体就是分解部分粗纤维、粗蛋白等大分子物质，生成单糖、双糖、氨基酸等小分子物质，不仅提高了饲料的消化吸收率，而且起到深度生化加工作用[1]。微生物发酵过程中产生并积累大量营养丰富的微生物菌体蛋白及其它有用的代谢产物，如有机酸、醇、酯、维生素、微量元素等，使饲料变软变香，增加营养，最终形成适口性好、营养丰富、活菌含量高的生物饲料[2]。汤小朋等[3]研究黑曲霉固态发酵对木薯渣品质的影响，最优条件发酵后结果表明：与对照组相比，以干物质为基础，粗纤维含量由22.26%降低到17.71%，还原糖含量由1.42%提高到5.11%，粗蛋白质含量由8.67%提高到13.48%，粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%，粗灰分含量由6.02%提高到7.31%，显著提高木薯渣的营养价值。畜禽日粮中添加木薯渣的研究很多，蒋建生等[4]研究表明，在肉鸭育雏期（1～14日龄）添加1%发酵木薯渣饲料替代全价饲料有利于促进雏鸭饲料转化。潘慧华等[5]研究结果表明，在肉用鸭的0～2周龄、3～4周龄和5～7周龄日粮中分别添加2%、4%和8%的木薯渣用来替代三七糠既能满足肉鸭对粗纤维的需求，同时降低饲料的成本。于向春等[6]用不同复合菌剂发酵木薯渣，以不同的比例进行混合替代文昌鸡饲料，结果对文昌鸡的生长影响不大，所以发酵木薯渣可替代部分文昌鸡饲料以降低成本。张伟涛等[7]将不同发酵方式处理后的木薯渣添加到罗非鱼的饲料中，既能被鱼体充分吸收利用，又能满足罗非鱼正常的营养需求。蔡永权等[8]研究表明，以青贮木薯渣为主料，搭配2 kg精料添加，18～25月龄肉牛平均日增重达到0.591 kg，饲养成本被降低，质量增速较快，可以获得不错的经济效益。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌BI1、枯草芽孢杆菌B10-5；产乳酸菌：凝结芽孢杆菌、发酵乳杆菌，均由本实验室保藏。

1.2 木薯渣固体发酵饲料配方

木薯渣70%、玉米淀粉渣20%、玉米皮10%。

1.3 培养方法

1.3.1 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，NaCl 10 g/l，pH值7.2。

肉汤培养基：牛肉膏5 g/l，蛋白胨10 g/l，NaCl 5 g/l，pH值7.2～7.4。

淀粉培养基：牛肉膏5 g/l，蛋白胨5 g/l，NaCl 5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，琼脂18 g/l，pH值7.2。

MRS培养基：蛋白胨10 g/l，牛肉膏10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，葡萄糖 5 g/l，CH3COONa 5 g/l，柠檬酸二胺2 g/l，吐温-80 1 g/l，K2HPO42 g/l，MgSO4·7H2O 0.2 g/l，MnSO4·7H2O 0.05 g/l，CaCO320 g/l，pH值6.2。

麦康凯琼脂培养基：蛋白胨20 g/l，乳糖10 g/l，牛胆盐 5 g/l，NaCl 5 g/l，中性红0.03 g/l，琼脂18 g/l，pH值7.0。

1.3.2 芽孢杆菌种子液制备

从LB培养基斜面上挑取1环菌，接入到装有50 ml肉汤培养基的250 ml三角瓶中，放置于温度37℃、转速200 r/min的摇床中振荡培养12 h。

1.3.3 产乳酸菌种子液制备

从MRS液体培养基中吸取1 ml培养液，接入到装有50 ml MRS液体培养基的250 ml广口瓶中，放置于温度37℃的恒温培养箱中静置培养20 h。

1.3.4 木薯渣固态发酵饲料

将枯草芽孢杆菌BI1、枯草芽孢杆菌B10-5、凝结芽孢杆菌、发酵乳杆菌菌液按比例与一定量的水混合，然后与木薯渣饲料混匀，装入发酵袋中培养。

1.3.5 乳酸含量的测定

准确称取发酵饲料5.00 g置于装有50 ml蒸馏水的250 ml的三角瓶里，充分摇匀并浸提1 h，之后离心取上清液，稀释相应倍数后用生物传感分析仪测定其中的乳酸含量。

1.3.6 活菌数的测定[9]

芽孢杆菌用可溶性淀粉固体培养基作为计数培养基；产乳酸菌用MRS固体培养基作为计数培养基；大肠杆菌用麦康凯固体培养基作为计数培养基。

1.4 发酵条件的单因素优化

1.4.1 两株芽孢杆菌混合比例的确定

选取两株芽孢杆菌比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3这5个水平进行分析。

1.4.2 两株产乳酸菌混合比例的确定

选取两株产乳酸菌比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3这5个水平进行分析。

1.4.3 芽孢杆菌与产乳酸菌混合比例的确定

选取芽孢杆菌与产乳酸菌比例为1∶2、2∶1、1∶1、3∶1、3∶2这5个水平进行分析。

1.4.4 总接种量的确定

选取接种量为1%、3%、5%、7%、9%这5个水平进行分析。

1.5 发酵温度的确定

选取温度为22、27、32、37、42 ℃这5个水平进行分析。

1.6 发酵条件的正交试验

在单因素试验的基础上，选取影响显著的因素进行正交试验。采用L9(33)型三水平三因素正交表，以芽孢菌与乳酸菌的接种比例、接种量、发酵温度3个因素作为考察因素，研究对发酵结果的影响。

1.7 育肥猪饲喂试验

1.7.1 试验动物和分组

将120日龄60头70 kg左右的健康的“杜×大×长”三元杂交生长肥育猪随机分成4组，每组3个重复，每个重复5头猪。

1.7.2 试验日粮与设计

试验设4个处理组，即对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组，分别饲喂0、5%、15%、25%不同比例木薯渣发酵饲料的基础日粮(见表1)。基础日粮营养水平参照NRC(2012)推荐量平衡日粮中的能量和各种营养物质。

表1 基础日粮组成和营养水平(风干基础)

1.7.3 饲养管理

进猪前要检查维修圈舍设备，并清扫圈舍，然后用2%火碱水溶液或其它消毒药消毒。按猪的体重、体质强弱等相近的原则分4组，每组3个重复，每个重复5头。进入猪舍后，舍内温度控制在16～21℃之间，相对湿度50%～70%之间，保持空气流通。自由采食，自由饮水，采用全自动饮水装置，预试期为3 d，正试期为30 d，每天清扫圈舍和除粪2次，保证猪舍内环境卫生良好，每周舍内通道用2%火碱溶液或其它消毒药消毒1次。平时经常观察猪群采食、排粪情况、健康状况和精神状态，发现疫病及时隔离治疗。每周统计试验猪采食量和增重，及时检测试验猪粪便中的微生物。

1.7.4 测定指标

生长性能指标：分别于试验的开始和结束对所有试验猪进行空腹称重，根据每个圈舍试验猪的总重量和头数来计算平均头重，再根据平均头重的初重和末重来计算出平均日增重。每周要记录各组试验猪的采食量，试验结束后结算各组试验猪消耗饲料的总重，计算出平均日采食量。根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。

粪便中微生物的测定：分别在试验第15 d和第30 d时，即整个试验时期的中期和末期，进行猪粪便中微生物的测定，分别取每组试验猪1 h内的新鲜猪粪，并尽量取多只猪的粪便，然后混匀，准确称取粪便5 g置于装有生理盐水的三角瓶中，瓶内预置适当数量的玻璃珠，震荡15 min，使粪便中的微生物悬浮于生理盐水中，然后用十倍稀释法进行稀释，选取合适的稀释梯度进行涂布计数。乳酸菌用MRS培养基作为计数培养基，大肠杆菌用麦康凯培养基作为计数培养基。

1.8 数据处理

采用SPSS16.0统计分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 木薯渣发酵饲料两株枯草芽孢杆菌混合比例的优化（见表2）

表2 两株芽孢菌混合比例对木薯渣发酵饲料的影响

从表2可以看出，两株枯草芽孢杆菌的比例对乳酸含量和活菌总数都有影响，但影响都较小，比例为1∶2时，活菌总数有较高水平，乳酸含量也最高，从而确定木薯渣发酵饲料中两株枯草芽孢杆菌BI1和B10-5的比例为1∶2。

2.2 木薯渣发酵饲料两株产乳酸菌发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌混合比例的优化（见表3）

从表3可以看出，两株产乳酸菌的混合比例为1∶2时，活菌总数最高，但乳酸含量较低，当比例为1∶3时，乳酸含量最高，活菌总数也处于较高水平，从而确定木薯渣发酵饲料中发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌的比例为1∶3。

2.3 木薯渣发酵饲料芽孢杆菌与产乳酸菌混合比例的优化（见表4）

木薯渣发酵饲料中两株枯草芽孢杆菌BI1和B10-5的比例为1∶2，发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌的比例为1∶3，而芽孢杆菌与产乳酸菌混合接种比例见表4。

从表4可以看出，芽孢杆菌与产乳酸菌混合比例对乳酸菌数影响相对较小，芽孢杆菌与产乳酸菌混合比例为3∶2时，乳酸含量最高，且乳酸菌数也有较高的水平，所以确定木薯渣发酵饲料中芽孢杆菌与产乳酸菌比例为3∶2。

表3 两株产乳酸菌混合比例对木薯渣发酵饲料的影响

表4 芽孢杆菌与产乳酸菌混合比例对木薯渣发酵饲料的影响

2.4 木薯渣发酵饲料总接种量的优化

木薯渣发酵饲料中芽孢杆菌与产乳酸菌比例为3∶2，总接种量见表5。

表5 接种量对木薯渣发酵饲料的影响

从表5可以看出，当接种量超过5%以后，随着接种量的增加，乳酸含量增加效果并不明显，而且接种量太高，在生产过程中发酵饲料所需要的菌液也会很高，这样会增加生产成本，从结果可以看出，5%的接种量各个指标也处于较高水平，所以最终确定接种量为5%。

2.5 木薯渣发酵饲料温度的优化

两株枯草芽孢杆菌BI1和B10-5的比例为1∶2，发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌的比例为1∶3，木薯渣发酵饲料中芽孢杆菌与产乳酸菌比例为3∶2，总接种量5%。发酵温度见表6。

表6 温度对木薯渣发酵饲料的影响

从表6可以看出，在22℃和27℃较低温度木薯渣饲料不能很好地进行发酵，乳酸含量和产乳酸菌数很低，这说明低温使菌体的生长代谢受到抑制，从而影响产酸性能。在42℃较高温度下发酵虽然能达到一定的发酵效果，但是温度过高也会抑制菌株的生长，致使乳酸菌数少于在32℃和37℃发酵的结果。从结果可以看出，37℃下发酵效果很好，乳酸含量和乳酸菌数都达到较好的结果。

2.6 发酵条件的正交试验

以单因素优化的发酵条件，采用L9(33)型三水平三因素正交试验研究芽孢杆菌与产乳酸菌的接种比例、总接种量、发酵温度对发酵结果的影响，结果见表7。

表7 正交试验设计各因素及水平

以乳酸含量作为指标进行分析，如表8和表9所示。

表8 正交试验极差分析

表9 以发酵饲料中乳酸结果进行正交试验方差分析

通过正交试验中各组发酵产生的乳酸进行分析可以看出各因素无显著性影响，影响因子的主次顺序为：发酵温度＞接种比例＞接种量，从K值可以看出，A2B2C3发酵产生的乳酸最多，接种比例为3∶2，接种量为5%，发酵温度37℃。对A2B2C3这一组再次重复进行发酵验证，测得发酵后乳酸含量达到2.0%。

2.7 木薯渣发酵饲料对育肥猪生长性能的影响（见表10）

育肥猪饲喂到150日龄时，由表10可知，对照组末重远高于试验Ⅲ组，差异显著，略高于试验Ⅰ组和试验Ⅱ组，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的末重较为一致，也高于试验Ⅲ组。从平均日增重来看，试验Ⅱ组添加15%木薯渣发酵饲料的结果最高。从料肉比来看，对照组料肉比最低，与试验Ⅰ组和试验Ⅱ组差异并不大，但低于试验Ⅲ组的结果，可见添加适量木薯渣发酵饲料的可以刺激试验育肥猪的采食，但是不宜添加过量。

2.8 育肥猪粪便中微生物的测定（见表11）

表10 木薯渣发酵饲料对育肥猪生长性能的影响

表11 猪粪中微生物的检测结果

通过对各组猪粪中大肠杆菌数、乳酸菌数以及芽孢杆菌数的测定，从表11可以看出，试验Ⅱ组乳酸菌数最高，芽孢杆菌数也有较高水平，但四组之间没有显著差异。饲料经过发酵后，猪采食后未能改善猪肠道内微生物环境，也可能与饲喂时间短有关。

3 结论

按最优发酵工艺进行发酵，总接种量为5%，枯草芽孢杆菌BI1与枯草芽孢杆菌B10-5接种比例为1∶2，产乳酸菌发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌接种比例为1∶3，芽孢杆菌与产乳酸菌接种比例为3∶2，发酵温度为37℃，发酵后木薯渣乳酸含量达到2%。添加不同比例木薯渣发酵饲料的基础日粮进行育肥猪饲喂试验，结果显示饲喂添加15%木薯渣发酵饲料的基础日粮的试验组具有较好的增重效果，平均日增重0.78 kg，平均日采食量2.8 kg，料肉比3.59，同时肠道内乳酸菌数量增加。由此可见，木薯渣发酵饲料可以部分代替基础日粮添加，并且具有较好的饲喂效果。