RANK基因甲基化与新疆不同民族老年男性高密度脂蛋白胆固醇的相关性

塔吉古丽·木沙，向红，白雪，李杨静，王红梅

（新疆维吾尔自治区人民医院干部保健二科，乌鲁木齐830001）

血脂异常是心脑血管疾病的独立而重要的危险因素，它所引起的各种严重疾病已经成为很多国家的重要致死和致残原因，因此积极调脂治疗对减少心脑血管疾病的发生有着非常重要的意义。

研究表明，血脂异常的发病与遗传因素和环境因素有关［1］。表观遗传学修饰可导致遗传性的表型变异［2］，其中DNA甲基化是表观遗传修饰的一种主要修饰方式［3］，是可逆的DNA自然化学的修饰方式。环境因素可能通过影响表观遗传修饰的变化，导致血脂异常。国内对核因子KB受体活化因子（RANK）基因甲基化的研究较少。本研究旨在探讨RANK基因甲基化在新疆老年男性中的分布情况，及其甲基化程度与高密度脂蛋白胆固醇的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究是以自然人群横断面流行病学调查为基础的病例—对照研究。即采用多级随机抽样的方法。2018年4月至2018年5月，对新疆木垒县和洛浦县有本地正式户口且65岁以上的长住汉族、维吾尔族、哈萨克族居民进行流行病学现况调查。调查前事先登记人口，保证应答率，保证入选个体均为无关个体。调查采用问卷调查方法，调查工作主要由经过统一培训的的专职人员填写表格、询问病史。所有研究对象均收集一般资料，抽取空腹状态下全血5 mL，现场离心分离血清和血液有形成分，血清在采血后1个月内检测血脂［包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）］、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FIns）等生化指标，血液有形成分在-80℃保存，以提取DNA。生化检测均在新疆维吾尔自治区人民医院检验科完成并由专人负责。

在以上获得人群样本中随机抽样，最后共有32位汉族、28位维吾尔族、30位哈萨克族老年男性入选本研究。

按《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》标准诊断中心性肥胖：男性腰围≥85 cm、女性腰围≥80 cm者为中心性肥胖。按照《中国成人血脂异常防治指南》标准诊断低高密度脂蛋白胆固醇血症：HDL-C＜1 mmol／L的个体判断为低高密度脂蛋白胆固醇血症。

在入选研究对象中，汉族低高密度脂蛋白胆固醇血症组（病例组）共18例、对照组14例；维吾尔族低高密度脂蛋白胆固醇血症组（病例组）共16例、对照组12例；哈萨克族低高密度脂蛋白胆固醇血症组（病例组）共16例、对照组14例。

所有研究对象均签署知情同意书。本研究通过新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会审查并同意实施。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血基因组DNA提取 抽取受试者外周血5 mL，-80℃保存。应用PAXgene Blood DNA kit试剂盒（QIAGEN，德国），并按照试剂盒中提供的“操作说明”中的标准操作步骤提取外周血基因组DNA。

1.2.2 RANK启动子区甲基化检测 使用Methyl Primer Express v1.0设计重亚硫酸盐测序引物：上游引物 5′-GGTGCCTTTCTAGAATTTGGTGG-3′；下 游引 物：5′-CCAACCCTAAATTACCCTTCAC-3′，PCR产物长度376 bp，共20个CpG位点。

应用 EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits（QIAGEN，德国）进行基因组甲基化修饰，并对修饰后的DNA进行反复洗脱、纯化，洗脱纯化的DNA放入-20℃保存。取质检合格的上述基因组DNA样本进行PCR扩增，并将PCR扩增产物回收。回收的PCR扩增产物送上海生工测序，并采用BiQ Analyzer分析软件对RANK基因组标准序列和测序序列进行比对。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件包进行数据处理。计量资料用x±s表示，计数资料采用例数或者百分数表示。组间临床表型计量资料比较采用t检验（两组间）或单因素方差分析（3组间），分类资料采用χ2检验。并采用协方差分析，在校正年龄、吸烟、饮酒、血脂及高血压、糖尿病患病率后，分析对照组、病例组RANK基因CpG岛甲基化率差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性研究对象临床特征 在汉族研究对象中，病例组、对照组间高血压患病率的差异有统计学意义（P＜0.05）；在哈萨克族研究对象中，病例组、对照组间的高血压患病率、肥胖患病率的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性RANK基因甲基化率差异 在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性中，RANK基因CpG岛甲基化率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 RANK基因甲基化与新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性高密度脂蛋白胆固醇相关性 在新疆维吾尔族、哈萨克族老年男性中，对照组RANK基因CpG岛甲基化率低于病例组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在汉族老年男性中，对照组RANK基因CpG岛甲基化率低于病例组，差异无统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表1 新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族研究对象临床资料分析

表2 新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性RANK基因甲基化率差异

采用协方差分析，校正年龄、吸烟、饮酒及高血压、糖尿病、肥胖患病率后，在新疆维吾尔族、哈萨克族老年男性中，对照组RANK基因CpG岛甲基化率低于病例组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 新疆汉、维吾尔、哈萨克族高密度脂蛋白胆固醇与RANK基因甲基化相关性分析

3 讨论

血清HDL-C水平反映了遗传和环境因素间的相互作用，据研究报道，50%以上人类HDL-C水平的变异由遗传因素所引起［4］。DNA甲基化是一种可遗传性的、与心脑血管危险因素相关的可修饰的表观遗传标记，而且人类基因组约70%的CpG位点存在甲基化。脂质代谢的调控基因众多，本研究的目的是识别与血清脂质水平相关的DNA甲基化差异位点。本研究通过在新疆维吾尔族、哈萨克族、汉族自然人群中的研究发现，新疆维吾尔族、哈萨克族老年低高密度脂蛋白胆固醇血症可能与RANK基因甲基化率变异有关，RANK基因甲基化率增高可能是低高密度脂蛋白胆固醇血症的危险因素。

护骨素（OPG）、RANK和其配体-核受体KB激活受体配体（RANKL）是 RANKL／RANK／OPG信号通路中的三个主要蛋白。RANKL／RANK／OPG系统是一个成骨细胞、破骨细胞相互作用的信号通道，在调节骨代谢过程中起很关键的作用。近年来随着研究的进一步深入，发现RANKL／RANK／OPG不仅在参与调节骨代谢，在免疫、炎症、动脉粥样硬化、血管钙化、细胞凋亡及肿瘤转移等方面均起着重要的作用，它还参与了人体内许多疾病发生发展的重要病理生理过程，如冠心病、外周动脉疾病、高血压、糖尿病、类风湿关节炎等［5-7］。另一项研究报道，通过阻断RANKL／RANK／OPG信号通路能够改善胰岛素抵抗，可能预防糖尿病的发生［8］。

研究发现，RANKL／RANK／OPG在脂肪代谢中发挥重要作用［9-11］，OPG可能通过调节脂肪酸摄取基因CD36、核受体基因PPARγ、ERK信号通路调节三酰甘油［12］。而在本研究中。也发现低高密度脂蛋白胆固醇血症可能与RANK基因CpG岛甲基化水平增高存在有相关性，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，本研究结果发现，在维吾尔族、哈萨克族老年人群中，低高密度脂蛋白胆固醇血症患者中RANK基因CpG岛甲基化水平升高（P＜0.05），但在汉族人群中没有统计学意义。分析其原因，考虑多种因素有关：DNA甲基化不是静止的稳定状态，而是能够受到外界刺激发生变化的动态过程，研究提示孕妇产前、产后营养状况均可影响DNA甲基化及组蛋白修饰进而影响免疫及代谢系统［13］；另有研究表明：高脂肪饮食、年龄、环境均会影响DNA甲基化程度的改变［14-15］，维吾尔族、哈萨克族人群具有特殊的膳食习惯和生活方式，膳食中主要以肉制品和奶制品为主，高脂肪、高蛋白及高嘌呤饮食在膳食中占较大的比例，鱼类和蔬菜水果的摄入量相对较少。维吾尔族膳食结构中粮谷类、畜禽肉类及水果类摄入量达到或接近中国居民平衡膳食宝塔（2016）要求；蔬菜类及蛋类的摄入量低于宝塔建议值；油脂、乳类及盐类的摄入量高于宝塔建议值［16］。故此研究结果还需要进行深入研究及大样本实验研究的验证。

总之，本研究发现RANK基因的甲基化率增高可能与新疆维吾尔族、哈萨克族老年男性低高密度脂蛋白胆固醇血症相关，为探讨低高密度脂蛋白胆固醇血症发生发展的可能遗传机制提供了依据。当然，由于基因的表达受到翻译、转录、蛋白合成过程中多种因素的影响和调控，所以RANK基因甲基化在脂质代谢中的作用还有待于进一步研究。