益母草抗结核分枝杆菌成分的跟踪分离

韩立芬，宋善敏，甘梦兰，王仁凤，杨再昌

贵州大学药学院，贵阳 550025

结核(tuberculosis,TB)是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的可侵犯全身各器官的一种慢性传染病。结核分为肺结核和肺外结核，其中女性盆腔结核近年来有增长的趋势[1，2]。女性盆腔结核是指女性盆腔包括盆腔生殖器官(卵巢、输卵管、子宫)及盆腔腹膜与子宫周围的结缔组织的炎症。患者可出现消瘦、疲劳、发烧、出汗、乏力等症状，常伴随盆腔痛、月经异常、痛经、闭经、月经量少等症状，是导致女性不孕的重要原因[3-6]。目前，主要使用抗痨药物对女性盆腔结核实施治疗,一线抗结核药物缺乏子宫靶向性，必须长期服药,由于这类药物肝毒性明显,患者往往不能坚持服药,导致治疗失败。因此，研发子宫靶向性的抗结核新药对盆腔结核的治疗具有重要意义。

益母草是唇形科益母草属植物益母草(Leonurusartemisia(Laur.)S.Y.Hu F)的新鲜或者干燥地上部分。古代文献将益母草的功效归属于治疗妇产科疾病，比如：《本草衍义补遗》说“益母草治产前产后诸疾”、《本草纲目》说“益母草治妇人胎产诸病”、《本草蒙筌》说“益母草总调胎产诸证”、《本草求真》说“益母草消水行血，去瘀生新，调经解毒，为胎前胎后要剂”。在现代医学实践中，益母草被制成“益母草膏”、“益母草颗粒”、“益母草注射液”等剂型 ，用于治疗痛经、闭经、子宫阴道出血，具有促进产后子宫复旧及清理产后子宫残留物等功效[7-14]。可见，益母草对子宫及其附件的多种病理过程具有明显的干预作用，那么，益母草是否具有子宫靶向性、是否具有抗子宫结核的作用？迄今少见相关的文献报道。

为发现具有子宫靶向性的抗结核药物，我们对20多种具有治疗女性盆腔类疾病的中草药进行了抗结核杆菌体外试验，部分品种显示出抗结核杆菌活性，其中益母草乙醇提取物在改良罗氏培养基中能抑制结核分枝杆菌生长。对益母草进行抗结核分枝杆菌活性跟踪分离，得到活性单体YMC04，报道如下。

1 材料与方法

1.1 药材

益母草(2 700 g)购自贵阳市和平药房，为除根外的细叶益母草全株。

1.2 仪器与试剂

核磁共振数据用INOVA400 MHz型超导核磁共振仪测定，TMS作内标；质谱数据用HP-5973型质谱仪测定；柱色谱用硅胶(200～300目)、硅胶H和薄层色谱用硅胶GF254均为青岛海洋化工产品；改良罗氏培养基基础(上海博微生物科技有限公司)，7H9肉汤(Difco)，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 益母草的提取与活性跟踪分离

1.3.1 益母草的提取与分段

益母草样品2 700 g用80%的乙醇加热回流提取三次，每次一小时，合并提取液，过滤，置于70℃水浴蒸干，得乙醇提取物浸膏140 g。浸膏用10%乙醇水溶液溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位(45 g)、乙酸乙酯部位(40 g)、二氯甲烷部位(8 g)、剩余物(49 g)，不同萃取部位用改良罗氏培养基绝对浓度法进行活性跟踪，发现乙酸乙酯、二氯甲烷萃取部位能抑制结核杆菌，乙酸乙酯萃取部位活性更强，因此将乙酸乙酯萃取部位视为有效部位。

1.3.2 益母草乙酸乙酯萃取部位的活性跟踪与分离

乙酸乙酯萃取部位用硅胶柱色谱(200～300目)分离，干法装柱，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(4∶1～3∶2)进行梯度洗脱，最后甲醇冲柱，经TLC检测，合并相似成分,得到六个组分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)(图1)。利用改良罗氏培养基进行活性跟踪，发现有效组分为Fr.C(22-33)。

图1 益母草乙酸乙酯萃取部位的分离Fig.1 Separation of ethyl acetate extract from Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

1.3.3 Fr.C的活性跟踪与分离

Fr.C进行硅胶柱色谱(200～300目)分离，用二氯甲烷：甲醇(20∶1～15∶1)作洗脱剂进行梯度洗脱，得到四个组分(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4)(图2)。

利用改良罗氏培养基进行活性跟踪，有效组分为Fr.2。Fr.2经硅胶柱色谱多次纯化，得到单体YMC04(化合物1，400 mg)。

1.4 抗结核分枝杆菌测试绝对浓度法

改良罗氏培养基 40.84 g，加入12 mL的甘油，加蒸馏水600 mL煮沸5～10 min，115 ℃灭菌 20 min，待冷至55 ℃左右时以无菌操作加入1 000 mL无菌搅匀的全蛋液，混匀，分装在15 mm×150 mm 的试管，每管5 mL[15]。称取样本，用二甲基亚枫(DMSO)溶解，分别加入到含有改良罗氏培养基试管中，根据预实验确定浓度，每个浓度做3管，平行做2次，阳性对照为异烟肼(2 μg/mL)，阴性对照为含5% DMSO的无药培养基，放置成斜面，80 ℃下加热灭菌1 h，隔夜后相同条件下加热灭菌1 h，冷却后接种H37Rv菌悬液(108CFU/mL) 20 μL，使菌液由上往下分布在培养基斜面上，置 37 ℃的电热恒温培养箱中培养20天。在培养期间，每天观察记录一次。结果判断：菌落数低于5个(含5个)视为有效，其中菌落0～1个记“+++”，2～4个记“++”，5个记“+”，菌落数在6个以上(含6个)视为无效，记“-”。

图2 Fr.C的分离Fig.2 Separation of Fr.C

2 结果

2.1 活性跟踪

采用改良罗氏培养基绝对浓度法对益母草乙醇提取物不同萃取部位进行活性测试，结果见表1，可见活性最强的部位为乙酸乙酯萃取物。

表1 益母草不同萃取部位的活性跟踪Table 1 Bioassay of different extraction parts of Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，得到六个组分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)，采用改良罗氏培养基进行活性跟踪，确定Fr.C为活性部位(表2)，其抑制结核杆菌的MIC值为0.4 mg/mL。

表2 益母草乙酸乙酯部位的活性跟踪Table 2 Bioassay of ethyl acetate fraction in Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

Fr.C进一步进行硅胶柱色谱分离得到活性组分Fr.2，Fr.2再经硅胶柱色谱反复纯化，得到活性单体化合物1，经改良罗氏培养基进行活性测试，化合物1的MIC值为80 μg/mL。

2.2 结构鉴定

化合物1白色针晶(MeOH)；mp.195～196 ℃。1H NMR (400 MHz，CD3OD ) δ (ppm)：7.26 (s,2H),5.07 (s,2H),4.33 (t,J=12 Hz,4 Hz,2H),3.83 (s,6H),3.49 (s,1H),3.38 (dt,J=6 Hz,4 Hz,2H),3.31 (p,J=4 Hz,2H),3.29 (s,1H),3.27 (s,1H),1.86 (m,2H),1.76 (m,2H)。ESI-MS：m/z312 [M+H]+。经薄层层析，用改良的碘化铋钾显色呈砖红色。与益母草碱对照品经TLC检测，其Rf值一致，氢谱、质谱数据与文献[16]对照基本一致，确定化合物1为益母草碱(图3)。

图3 益母草碱结构式Fig.3 Structural formula of leonurine

3 讨论

益母草常用于月经不调，痛经闭经，恶露不尽，疮疡肿毒等症，是妇科疾病的常用药。益母草的化学成分主要有生物碱(益母草碱、水苏碱、益母草啶、益母草宁)、黄酮类、二萜类、环形多肽、阿魏酸等小分子化合物[17]。益母草碱的药理作用较多，具有舒张冠脉、抑制ATP的合成、抑制炎症因子的信号通路、抑制糖异生、促进子宫收缩等作用[18]。目前未见益母草碱抗结核杆菌活性的报道。

从结构上看，益母草碱(3，5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸 (4-胍基)-1-丁酯)属于有机胺类生物碱，含有三个N原子，与一线抗结核药物异烟肼类似，异烟肼同样含有3个N原子，一个N组成吡啶环，另外两个N原子形成肼基，而在益母草碱中，三个N原子以胍基的形式存在，由此我们推测，益母草碱抗结核杆菌机制可能与异烟肼类似。

在我们的初步试验(尚未报道)中发现，益母草碱在大鼠子宫及其附件中的分布大于异烟肼，这一结果有待扩大样本量进一步证实。同时我们拟对益母草碱进行结构修饰，提高其抗结核杆菌活性并增加其在子宫中的分布，为治疗子宫结核提供新的线索。