蛇足石杉产石杉碱甲内生真菌SNZ-12的分离及鉴定

张宏庆，张 恬，张学智，徐文静，李浩东，刘 盼，张 鹏，宋发军

中南民族大学生命科学学院 生物技术国家民委重点实验室 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074

石杉碱甲(Huperzine A)是治疗老年痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)的临床药物，其临床应用一般以口服的固体药片、胶囊为主，具有高度的选择性抑制乙酰胆碱酯酶活性和增强脑内胆碱能神经元的功能，且对多种实验性记忆损害均有改善作用，具有广泛的开发应用价值[1-3]。但其药源植物蛇足石杉(Huperzineserrata)资源匮乏、生长缓慢，且石杉碱甲含量低[4,5]，仅依靠从蛇足石杉获取石杉碱甲无法满足市场需求。内生菌是具有极大开发价值的新的石杉碱甲药源途径之一[5,6]。目前，已有多株内生菌被报道可产石杉碱甲。Dong等[7]从蛇足石杉分离获得3株产石杉碱甲内生真菌，其中木霉菌(Trichodermasp.)L44的石杉碱甲产量最高(37.63 μg/g)。Wang[8]和Zhu[6]等从蛇足石杉的根、茎和叶组织分离获得9株产石杉碱甲内生真菌，其中竹黄菌(Shiraiasp.)Slf14的石杉碱甲的产量为327.8 μg/L，王吉祥通过优化培养温度、接种量、培养基初始pH值、摇床转速等条件，将竹黄菌Slf14的石杉碱甲产量提高至660 μg/L[9]。Su等[10]从蛇足石杉分离获得石杉碱甲产量为21.0 μg/L的内生真菌—纤姿拟青霉(Paecilomycestenuis)YS-13。汪涯等[11]从蛇足石杉分离获得石杉碱甲产量为80.1 μg/g的黄曲霉(Aspergillusflavus)LF40。

本研究从野生蛇足石杉共分离获得形态各异的内生真菌60株，通过HPLC和MS检测各个真菌的发酵物，发现只有编号为SNZ-12的菌株可以产石杉碱甲，其石杉碱甲产量约为1.01 mg/L，并结合形态学观察和18S rDNA序列分析，将SNZ-12菌株初步鉴定为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

1 材料与方法

1.1 材料

蛇足石杉植株采集自湖北省恩施州巴东县。真菌SNZ-12为分离自蛇足石杉的一株内生真菌。PDA及PDL培养基的组成和配制参见文献[12]；石杉碱甲标品(B21166；纯度≥98%)购自上海源叶生物科技公司；其他试剂均为国产分析纯或色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离和纯化

新鲜蛇足石杉用自来水清洗后，分别用0.1%升汞和75%酒精浸泡20 min和5 min，经无菌水冲洗后，加入适量生理盐水，并轻柔研磨成浆，适当稀释并涂布在PDA平板上，25～28 ℃静置培养。根据真菌生长情况，将其接至新的PDA平板继续培养，并采用菌丝顶端分离法多次纯化获得的单克隆。

1.2.2 石杉碱甲的提取及分析

石杉碱甲的提取及HPLC分析参照[13]：(1)将纯化后的菌株接种至100 mL PDL培养基中，28 ℃、150 rpm培养15天，用3层纱布过滤收集菌体，55 ℃烘干并研磨成粉；(2)称取1.0 g菌粉，经0.8%稀硫酸浸泡48 h、超声辅提30 min后，用氢氧化钠将其调至pH=10.0，再用10 mL氯仿抽提，12 000 rpm离心3 min，吸取下层有机相。抽提三次并合并抽提液，65 ℃减压蒸干，用1 mL色谱级甲醇溶解蒸馏残余物，并用0.22 μm滤膜过滤后，用于HPLC和MS分析。(3)HPLC初筛条件：ODS-C18反相柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相为甲醇：水=65∶35；流速为0.5 mL/min，紫外波长设定为310 nm，柱温为20 ℃，进样量为20 μL。HPLC复筛条件：流动相为甲醇：水=55∶45，其它条件同HPLC初筛条件。根据石杉碱甲标品和真菌样品的相应峰面积比，计算内生真菌的石杉碱甲产量。(4)MS分析由中南民族大学分析测试中心采用Agilent 1100 LC /MSD trap系统完成，色谱柱、流动相、紫外波长、柱温和进样量同HPLC条件，流速为2 μL/min，电压为2.2 KV，离子源为ESI+。

1.2.3 菌株SNZ-12的形态特征观察及18S rDNA序列分析

将菌株SNZ-12接种于PDA平板， 26 ℃培养6～10天，培养过程中观察其菌落形态、颜色、质地等特征，并用接种针挑取少量菌丝于载玻片上，制作临时装片，在光学显微镜下观察其菌丝和孢子的形态特征，并根据《真菌鉴定手册》[14]对菌株进行初步鉴定。

以菌株SNZ-12的基因组DNA为模板，采用引物18S-F1(5′-GATCCTGCCAGTAGTCATATGC-3′)和18S-ITS2(5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′)扩增其18S rDNA序列。扩增条件为：96 ℃ 5 min，93 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，68 ℃ 50 s，共30个循环；然后，68 ℃再反应5 min。扩增产物测序后，经Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)在线比对分析。

2 结果与分析

2.1 产石杉碱甲内生真菌的筛选

本研究共分离获得60株形态各异的内生真菌。采用HPLC初筛条件检测各个真菌的提取物，发现只有编号为SNZ-12菌株的提取物(4.277 min)具有与石杉碱甲标品(4.279 min)相近的特征峰及其保留时间(Fig.1A、B)；通过改变流动相，采用HPLC复筛条件再次检测内生真菌SNZ-12提取物，发现其(8.900 min)依然具有与石杉碱甲标品(8.994 min)相近的特征峰及其保留时间(Fig.1C、D)，初步表明内生真菌SNZ-12可以产石杉碱甲，其石杉碱甲产量约为1.01 mg/L。之后，对内生真菌SNZ-12提取物进行质谱分析，结果表明：H+轰击后，内生真菌SNZ-12提取物中含有与石杉碱甲标品((M+H)+=243.1)相同的质谱特征峰，进一步证明生真菌SNZ-12可以产石杉碱甲。

2.2 产石杉碱甲内生真菌SNZ-12的鉴定

内生真菌SNZ-12于26 ℃条件下在PDA平板上培养7天后，其菌落直径约为8 cm，初生菌丝为白色，气生菌丝不发达并紧贴培养基(Fig.3A)；菌落背面初为乳白色，随着培养时间延长逐渐转为浅紫色(Fig.3B)；菌丝光滑无色、分枝、有隔(Fig.3C)；分生孢子无色、多胞、有隔、略弯曲，两端细胞稍尖(Fig.3D)。参照《真菌鉴定手册》[14]发现内生真菌SNZ-12与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的形态特征相似。

图1 石杉碱甲标品(A,C)及内生真菌SNZ-12提取物(B,D)的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of authentic Huperzine A (A,C) and the extract of endophytic fungus SNZ-12 (B,D)

图2 石杉碱甲标品(A)及内生真菌SNZ-12提取物(B)的质谱分析Fig.2 Electrospray mass spectra of authentic Huperzine A (A) and the extract of endophytic fungus SNZ-12 (B)

图3 内生真菌SNZ-12的菌落(A,B)、菌丝体(C)和分生孢子(D)的形态特征Fig.3 Morphological observation of the colony (A),colony reverse(B),hyphae (C) and conidiophores (D) of endophytic fungus SNZ-12 (Magnification with 400×)

内生真菌SNZ-12的18S rDNA 序列分析结果(Fig.4)表明，其与Fusariumoxysporumf.sp.dianthi的 18S rDNA 序列(GenBank no.LT841236.1)、F.oxysporumf.sp.cumini的18S rDNA 序列(GenBank no.LT841208.1)、F.proliferatum的18S rDNA序列(GenBank no.LT841264.1)、Fusariumsp.LL-X4的18S rDNA序列(GenBank no.EF397557.1)分别具有99%的一致性(identity)。结合内生真菌SNZ-12的形态特征，将其初步鉴定为尖孢镰刀菌。

图4 内生真菌SNZ-12的18S rDNA系统进化分析Fig.4 The phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequences of endophytic fungus SNZ-12

3 讨论

镰刀菌(Fusariumsp.)是常见植物内生真菌之一，分布范围广、种类繁多，已报道的镰刀菌有500多种[15]。目前，已有多篇关于从蛇足石杉植物分离到镰刀菌的报道，例如，贺乐等从蛇足石杉分离到一株内生镰刀菌JSM10[16]；孙勇等自蛇足石杉等植物分离到62株内生镰刀菌，分属6个种，包括尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、串珠镰刀菌(F.proliferatum)、砖红镰刀菌(F.lateritium)、木贼镰刀菌(F.equiseti)等[17]；韩文霞等从蛇足石杉分离到产石杉碱甲的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)NSG-1[18]和轮枝镰孢菌(F.verticillioides)NSH-5[19]；闵长莉等自蛇足石杉中分离到产石杉碱甲的镰刀菌(Fusariumsp.)WX13[20]。这些结果表明，镰刀菌不仅是蛇足石杉的代表性内生菌，也是重要的产石杉碱甲内生菌资源之一。

根据文献报道，尖孢镰刀菌NSG-1[18]和轮枝镰孢菌NSH-5[19]在PDL培养基于28 ℃培养5天后，该菌株的发酵液(去除菌体的上清液)中石杉碱甲产量分别为11.1 mg/L和117.6 mg/L；这应是目前报道的石杉碱甲产量最高的菌株，而且达到该产量所需的发酵时间仅为5天，并且石杉碱甲都是分泌在培养基中(该文献没有报道菌丝体的石杉碱甲含量)。镰刀菌WX13在PDB(potato-dextrose broth)培养基培养7天后，收集菌丝体并检测发现其含有石杉碱甲，但没有报道具体产量，也没有报道发酵液中是否含有石杉碱甲[20]。本研究分离的尖孢镰刀菌SNZ-12在PDL培养基中培养5天时，其菌丝体较少，发酵液中没有石杉碱甲；培养15天后，菌丝体中可以检测到石杉碱甲，产量约为1.01 mg/L，但培养15天的发酵液(去除菌体的上清液)中依然检测不到石杉碱甲，说明尖孢镰刀菌SNZ-12合成的石杉碱甲主要存在于细胞内。通过比较不同产量以及不同石杉碱甲合成特性的镰刀菌，比如高产且分泌型合成石杉碱甲的尖孢镰刀菌NSG-1以及产量较低且胞内型合成石杉碱甲的尖孢镰刀菌SNZ-12，有助于揭示不同镰刀菌的石杉碱甲的合成及调控机制，而本文所报道菌株为该研究提供了菌种资源。