芍药苷抑制佐剂性关节炎大鼠FLS异常增殖①

缪成贵 周丽丽 熊友谊 魏 伟 陈兵兵 常 俊

(安徽科技学院生命与健康科学学院，凤阳 233100)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、持续性的自身免疫性疾病，发病特征集中在手、足小关节等处，呈对称性、侵袭性关节滑膜炎症，并发展为软骨侵蚀、骨的不可逆性损坏[1]。RA伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，严重者导致关节畸形及功能丧失[2]。RA发病机制目前仍不清楚，研究表明关节滑膜中成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes，FLS)的异常增殖在RA发病机制中起关键作用[3]。完全弗氏佐剂制备的佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠病理特点与人RA非常相似，是常用的RA病理机制研究和药物治疗研究的动物模型[4]。芍药苷(Paeoniflorin,PF)来源于中药材毛莨科植物芍药根、牡丹根、紫牡丹根，作为中药材芍药中的主要有效成分，具有镇痛镇静、扩张血管、抗炎抗溃疡、解热解痉等药理作用[5]。本文以AA大鼠作为RA研究的动物模型，以FLS异常增殖作为研究切入点，从分子水平深入研究PF影响AA大鼠病理的机制，为RA防治提供新思路新方法。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器设备 倒置荧光显微镜：日本OLYMPUS公司；实时定量PCR仪：美国ABI公司；超纯水系统：美国密理博Milli-Q Reference；酶标仪：美国BioTek公司；台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；-80℃超低温冰柜：日本三洋公司；细胞培养箱：美国热电公司；超净工作台：上海智城ZHJH-C1214C；紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器公司；电子天平BP211D：德国Sartarius。

1.1.2药品试剂 PF：上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，规格20 mg/支，CAS 23180-57-6；QuantiFast®SYBR®Green PCR试剂盒：德国Qiagen公司产品；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒：美国Fermentas公司产品；Opti-MEM：美国Invitrogen公司；新生胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)：美国Hyclone公司产品；ELISA：上海源叶生物科技有限公司；MTT、焦碳酸二乙酯(DEPC)：美国Sigma公司产品。

1.2实验方法

1.2.1AA大鼠制备及大鼠足爪肿胀评分 SD雄性大鼠，体重180～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号：皖医动准01号)。适应性饲养7 d后，除正常组外，其余各组采用大鼠右后足跖皮内注射0.1 ml完全弗氏佐剂致炎的方法制备AA大鼠。对于PF灌胃给药，购入的实验大鼠适应性饲养后随机分为6组：正常组、AA组、PF 5 mg/kg、PF 10 mg/kg、PF 20 mg/kg组、PBS组(空白对照)，每组10只。对于PF细胞给药，分为6组：正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组(空白对照)。大鼠足爪肿胀评分对象包括五只指关节或趾关节，一只腕关节或踝关节，共24个评分对象，每个评分对象出现结节和红肿计1分，无结节和红肿计0分，每只大鼠的足爪肿胀评分最大值是24。

1.2.2FLS原代培养 AA大鼠制备后第28天股动脉放血处死大鼠，无菌条件下取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，取出大鼠双侧膝关节滑膜，无Ca2+、Mg2+D-Hanks液漂洗3次后剪成约1～2 mm3小块。用无菌玻璃吸管转移滑膜组织小块均匀排列在培养瓶中的底壁上，加2 ml含胎牛血清的DMEM细胞培养基，翻转培养瓶使瓶底朝上，置37℃、5%CO2培养箱内培养7 h，使其贴壁。取出培养瓶，加入预温的含胎牛血清的DMEM 1 ml培养基，再置37℃、5%CO2培养箱中继续培养3 d。3 d后更换培养基，待滑膜FLS长出组织块较多后，弃除组织块，继续培养。待细胞铺满细胞培养瓶瓶底达90%时，加胰蛋白酶0.5 ml消化细胞进行传代培养，实验用细胞为传代3～5次的FLS。

1.2.3MTT检测PF对AA大鼠FLS增殖的影响 取对数生长期FLS，胰酶消化制备1×105ml-1细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加入100 μl，铺板后细胞密度1 000～10 000个/孔。细胞培养箱内37℃、5%CO2培养6～8 h后，向FLS中加入PF 100、200、400 μg/ml，继续培养24 h。空白对照向FLS培养液中加入等量PBS。每孔加入20 μl MTT液(5 mg/ml，即0.5%MTT溶液)，继续培养4 h。终止培养，加样器吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床低速振荡10 min，酶标仪490 nm检测吸光度。

1.2.4Real time qPCR检测Bax、Caspase 3、Bcl-2、Fibronectin表达 分离培养各组大鼠FLS，细胞培养箱内5%CO2，37℃培养至3代后，加药PF 100、200、400 μg/ml 进入FLS培养液，继续培养48 h。空白对照向FLS培养液加入等量PBS。采用Trizol法(Qiagen)常规提取细胞总RNA，参照逆转录试剂盒(Fermentas)提供的方法逆转录得到各组细胞的cDNA，参照Qiagen公司试剂盒提供的Real time qPCR检测方法检测加药各组FLS中Bax、Caspase 3、Bcl-2、Fibronectin基因表达。mTOR基因扩增反应条件为：94℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s。共40个循环。定量PCR引物序列见表1。

表1RealtimeqPCR引物序列

Tab.1SequenceofrealtimeqPCRprimer

PrimerSense(5′ to 3′)Anti-sense(5′ to 3′)BaxTTGCTACAGGGTTTCATCCATGTTGTTGTCCAGTTCATCGCaspase 3ACGGGACTTGGAAAGCATCTAAGGAAGCCTGGAGCACAGBcl-2GGTGGACAACATCGCTCTGCAGCCAGGAGAAATCAAACAFibronectinGACACTATGCGGGTCACTTGCCCAGGCAGGAGATTTGTTAβ-actinCCCATCTATGAGGGTTACGC TTTAATGTCACGCACGATTTC

1.2.5ELISA检测IL-8表达 分离培养各组大鼠FLS，细胞培养箱内培养FLS至3代后，加药PF 100、200、400 μg/ml进入FLS培养液，继续培养48 h，空白对照向FLS培养液加入等量PBS。采用上海源叶生物科技有限公司提供的ELISA检测试剂盒检测IL-8表达，根据试剂盒提供的检测步骤设置标准品孔和样品孔。标准品孔加入不同浓度试剂盒提供的标准品50 μl，样品孔加待测样品10 μl，再加样品稀释液40 μl，空白孔作为对照不加试剂。标准品孔和样品孔中每孔再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体100 μl，37℃条件下封闭孵育60 min。然后弃净孔中试剂，每孔加满洗涤液静置1 min，再弃净洗涤液，重复此操作5次。然后每孔中加检测底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min，每孔最后加终止液50 μl，15 min内采用 450 nm波长测定各孔的OD值。

2 结果

2.2PF抑制AA大鼠FLS Fibronectin基因表达 PF加药后48 h，采用Real time qPCR检测Fibronectin在正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组大鼠FLS中的表达。结果显示，与正常组相比，Fibronectin在AA组大鼠FLS中相对表达量由1升高至3.285 5，差异有统计学意义(P<0.05)，与AA组相比，Fibronectin在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三组中表达显著降低，分别由3.285 5降低至2.365 8、2.307 7、2.297 6，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.3PF抑制AA大鼠FLS IL-8表达 PF加药后48 h，ELISA检测IL-8在正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组大鼠FLS中的表达。结果显示，与正常组相比，AA组IL-8的ELISA检测值由0.264 8升高至0.713 3，差异有统计学意义(P<0.05)。与AA组相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml各组中的IL-8的ELISA检测值分别由0.713 3降低至0.528 9、0.507 6、0.501 1，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。以上结果提示PF具有抑制AA大鼠病理的作用。

表2大鼠足爪肿胀评分

Tab.2Ratpawswellingscores

GroupsDay 16Day 20Day 24Day 28Day 32Normal group0.5±0.410.4±0.430.5±0.460.4±0.470.7±0.48AA group4.1±0.781)4.3±0.761)5.4±0.611)5.9±0.771)5.8±0.561)PF 5 mg/kg2.9±0.682)3.2±0.792)3.9±0.712)4.5±0.752)4.5±0.582)PF 10 mg/kg2.6±0.652)2.8±0.732)3.5±0.712)4.3±0.632)4.3±0.742)PF 20 mg/kg2.6±0.512)2.7±0.532)3.4±0.612)4.0±0.592)4.3±0.712)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05;compared with AA group,2)P<0.05,n=10.

图1 PF抑制AA大鼠FLS Fibronectin基因表达Fig.1 PF inhibits expression of Fibronectin in AA FLSNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

图2 PF抑制AA大鼠FLS IL-8表达Fig.2 PF inhibits expression of IL-8 in AA FLSNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

2.4PF抑制AA大鼠FLS增殖 PF加药后48 h，采用MTT检测正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组大鼠FLS增殖活力。结果显示，与正常组相比，AA组大鼠FLS的MTT检测值由0.095 6升高至0.410 8，差异有统计学意义(P<0.05)，与AA组相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三个组的MTT检测值显著降低，分别由0.410 8降低至0.308 8、0.291 7、0.290 9，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。提示PF具有抑制AA大鼠FLS增殖的作用。

图3 MTT检测PF对AA大鼠FLS增殖的影响Fig.3 MTT was used to detect effect of PF on FLS proliferationNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

图4 Real time qPCR检测PF对AA大鼠Bax、Caspase 3、Bcl-2表达的影响Fig.4 Real time qPCR was used to detect expression of Bax,Caspase 3,Bcl-2 in AA ratsNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

2.5PF促进AA大鼠FLS凋亡 PF加药后48 h，采用Real time qPCR检测Bax、Caspase 3、Bcl-2在正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组大鼠FLS中的表达。结果显示，与正常组相比，Bax、Caspase 3在AA组大鼠FLS中相对表达量分别由1降低至0.4365、0.7036，Bcl-2在AA组大鼠FLS中相对表达量由1升高至3.216 6，差异有统计学意义(P<0.05)，与AA组相比，Bax在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三组中表达显著升高，分别由0.436 5升高至0.795 2、0.7911、0.814 7，差异有统计学意义(P<0.05)；Caspase 3在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三组中表达也显著升高，分别由0.703 6升高至0.902 6、0.909 7、0.922 1，差异有统计学意义(P<0.05)；Bcl-2在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三组中表达显著降低，分别由3.216 6降低至2.248 5、2.233 9、2.105 7，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。以上结果提示PF对AA大鼠FLS凋亡具有促进作用，可能是通过促进AA大鼠FLS凋亡、抑制增殖达到治疗AA大鼠的作用。

3 讨论

尽管目前的研究较深入地阐述了RA的病理机制，但是RA发病机制仍然未能完全阐明，特别是持续的滑膜炎症和异常的滑膜增殖[6]。研究表明各种内源性和外源性抗原在不同程度上引发RA发生发展。内源抗原可能源自关节损伤导致的组织损伤，或者是细胞凋亡释放的自身固有而未被自身免疫系统识别的成分[7]。目前认为FLS的异常增殖活化在RA病理机制中起关键作用[8]。例如增生的FLS释放IL-6、IL-8、IL-15、基质细胞因子SDF-1等细胞因子和趋化因子[9]。FLS能够合成纤维连接蛋白、细胞黏附分子等细胞外基质蛋白，这些蛋白分子招募和驻留白细胞，进一步加重了病情。FLS同时促进B淋巴细胞分化，分泌基质金属蛋白酶MMP-3、基质降解酶，增强软骨的侵蚀和降解，最终导致骨的损坏和关节功能的破坏[10]。近年研究表明FLS参与了RA软骨侵蚀过程关键调控因子的合成释放，表达于FLS和T细胞上的NFκB配体RANKL与表达于单核细胞上的共用受体RANK相互作用起始了破骨细胞的分化和骨的重吸收，因此，FLS调控了具有侵蚀软骨的血管翳的形成。FLS具有干细胞的增生特性，滑膜增生可能源于关节损伤导致的滑膜细胞代偿性再生[11]。AA大鼠病理特点与人RA相似，是常用的RA研究动物模型。同时，鉴于FLS在RA发病机制中的关键作用，本试验分离培养AA大鼠FLS，以AA大鼠FLS为研究对象，检测相关分子的表达差异，探索PF对RA病理机制的影响。芍药苷来源于毛莨科植物芍药根、牡丹根等，主要包括羟基芍药甙、芍药花甙、芍药内酯甙、苯甲酰芍药甙等，具有镇痛镇静、抗炎抗溃疡、扩张血管、解热解痉、利尿等作用。本试验研究发现，与正常组相比，AA组大鼠的足爪肿胀评分明显升高，与AA组相比，各治疗组的足爪肿胀评分都显著降低，说明PF对AA大鼠有一定的治疗作用。在各组FLS培养液中加入PF 48 h后，采用Real time qPCR检测Fibronectin在正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组大鼠FLS中的表达。结果显示，与正常组相比，Fibronectin在AA组大鼠FLS中相对表达量显著升高，与AA组相比，Fibronectin在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三组中表达显著降低。ELISA检测IL-8在正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml、PBS组大鼠FLS中的表达。结果发现，与正常组相比，AA组IL-8的ELISA检测值显著升高，与AA组相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml各组中的IL-8的ELISA检测值显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示PF可能具有抑制AA大鼠病理机制的作用。

采用MTT检测正常组、AA组、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml组、PBS组大鼠FLS增殖活力。结果显示，与正常组相比，AA组大鼠FLS的MTT检测值显著升高，与AA组相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三组的MTT检测值显著降低，差异有统计学意义，说明PF具有抑制AA大鼠FLS增殖的作用。促凋亡基因Bax和细胞凋亡因子Caspase 3基因的激活表达促进细胞的凋亡，抗凋亡基因Bcl-2激活表达抑制细胞的凋亡，起到促进细胞增殖的作用[12]。在培养的各组FLS中加入PF 48 h后，采用Real time qPCR检测PF加药对AA大鼠FLS中Bax、Caspase 3和Bcl-2表达的影响。结果表明，PF具有显著上调Bax、Caspase 3表达，抑制Bcl-2表达的作用。PF可能是通过抑制FLS增殖、促进FLS凋亡的机制起到抑制AA大鼠病理发展的作用。本试验以FLS增殖凋亡为研究切入点，进一步阐明PF对RA动物模型病理影响的分子机制，为芍药苷药理药效研究提供了新的实验基础，为RA疾病防治提供新思路新方法。