不同价态铬胁迫对烟草幼苗氮代谢的影响

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(云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为云烟87和红花大金元(简称红大)，种子来源于玉溪中烟种子有限责任公司。供试硝酸铬、重铬酸钾以及配制Hoagland营养液所需化学试剂均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司和天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 试验方法

水培试验于2017年7—12月在云南农业大学烟草学院日光温室中进行。采用漂浮育苗体系培育云烟87和红大幼苗，待烟苗达到猫耳期时，选择长势较一致的幼苗移植到盛有500 mL Hoagland营养液(pH值6.0)的水培罐中并用锡箔纸包裹使根部避光，每天通气2 h，每3 d更换1次培养液(包括指标测定时)。预培养7 d后，向培养液中加入Cr3+、Cr6+溶液。培养液中Cr3+、Cr6+最终质量浓度分别为0(CK)、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L(Cr3+和Cr6+分别由硝酸铬、重铬酸钾提供)，每个处理设3次重复，每罐植烟3株，每个处理共植烟9株，在处理的第15天和第30天取样测定各指标。

1.3 测定项目及方法

在处理第15天和第30天用打孔器取3～6叶位一定质量的真叶，立即放入液氮中保存，随后进行相关指标测定。硝态氮、游离氨基酸、可溶性蛋白含量测定参考王小纯等[13]的方法；硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)活性和叶绿素含量测定方法参照《植物生理学实验指导》[14]；谷丙转氨酶(GPT)活性测定参照吴良欢等[15]的方法。

1.4 数据处理

试验数据用Excel 2013整理，用SPSS 19.0对数据进行显著性分析，用Origin 2017进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同价态铬对烟草幼苗氮同化的影响

2.1.1 硝态氮含量 由表1可知，除0.1～0.5 mg/L Cr3+处理30 d的红大幼叶硝态氮含量高于CK外，其他处理烟叶硝态氮含量均低于CK。在不同价态铬胁迫下，2个烤烟品种幼叶硝态氮含量的变化趋势大致相同：云烟87在Cr3+处理15、30 d和Cr6+处理15 d，以及红大在Cr3+、Cr6+分别处理15 d，幼叶硝态氮含量随铬质量浓度增加呈先降低后增加再降低趋势；而Cr6+处理30 d，2个烤烟品种幼叶硝态氮含量均随铬质量浓度增加而降低。其中，云烟87幼叶硝态氮含量在0.5 mg/L Cr3+处理下达到最高，但处理15、30 d时仍分别较CK降低11.0%、5.8%；而在0.5 mg/L Cr6+处理15、30 d时分别较CK降低14.3%、14.5%。红大幼叶硝态氮含量在0.5 mg/L Cr3+处理15、30 d时分别比CK降低15.6%、提高20.05%(P<0.05)；而在0.5 mg/L Cr6+处理15、30 d时分别比CK降低8.1%、22.7%。Cr3+胁迫下，处理30 d的烤烟幼叶硝态氮含量均高于处理15 d(云烟87 CK除外)。0.1 mg/L Cr6+胁迫下，处理30 d 2个烤烟品种幼叶硝态氮含量均高于处理15 d； 0.5～5.0 mg/L Cr6+胁迫下则低于处理15 d。0.1～5.0 mg/L Cr6+处理15 d，红大幼叶硝态氮含量高于云烟87；高质量浓度铬(1.0～5.0 mg/L)处理30 d，Cr3+处理的2个烤烟品种幼叶硝态氮含量高于Cr6+处理。

表1 不同价态铬胁迫对烟苗叶片硝态氮含量的影响 mg/g

注：数据为平均值±标准误差；同列不同小、大写字母分别表示同一品种不同质量浓度铬处理在5%、1%水平上差异显著、极显著，下同。

2.1.2 NR活性 从表2可以看出，Cr3+处理15、30 d，2个烤烟品种幼叶NR活性随铬质量浓度增加均呈先降低后升高再降低的趋势。云烟87、红大幼叶NR活性分别在0.5、1.0 mg/L Cr3+处理达到峰值，其中，处理15 d时2个品种分别为 9.08、9.07 μg/(g·h)，较CK分别增加18.4%、14.8%，处理30 d时分别为14.26、11.40 μg/(g·h)，较CK分别降低2.6%、8.4%。Cr6+处理下，2个烤烟品种幼叶NR活性随铬质量浓度增加而降低，尤其是Cr6+质量浓度增加至>1.0 mg/L后，NR活性极显著低于CK，但红大明显高于云烟87。5 mg/L Cr6+处理15、30 d，红大幼叶的NR活性较云烟87分别高43.7%、14.8%。相同铬质量浓度胁迫下，处理30 d的NR活性明显高于处理15 d。

表2 不同价态铬胁迫对烟苗叶片NR活性的影响 μg/(g·h)

2.1.3 GS活性 从图1可以看出，铬处理下2个烤烟品种的GS活性均低于CK。Cr3+处理15 d时，云烟87、红大幼叶GS活性随铬质量浓度增大均呈逐渐降低趋势，其中5 mg/L Cr3+处理下分别较CK显著降低45.2%、31.8%。Cr3+处理30 d和Cr6+处理15 d时，云烟87、红大幼叶GS活性随铬质量浓度增加均呈先降低后增加再降低的趋势，二者均在铬质量浓度为0.5 mg/L 时达到峰值，但仍分别较CK降低1.7%、19.3%(Cr3+处理30 d)和3.0%、12.9%(Cr6+处理15 d)。0.1、0.5 mg/L Cr6+处理15 d 2个烤烟品种幼叶GS活性与CK差异均不显著。Cr6+处理30 d时，云烟87、红大幼叶GS活性随Cr6+质量浓度增加而降低，其中0.1 mg/L Cr6+处理下分别较CK显著降低21.35%、30.28%。

不同小写字母表示同一价态铬胁迫相同时间不同质量浓度处理间在0.05水平上差异显著，下同

2.2 不同价态铬对烟草幼苗氮转化的影响

2.2.1 GPT活性 由图2可以看出，短时间Cr3+处理下，2个烤烟品种幼叶GPT活性呈降低—升高—降低的趋势。云烟87在0.5 mg/L Cr3+处理15 d时，幼叶GPT活性较CK降低5.1%，而在0.1 mg/L Cr3+处理30 d时GPT活性达到最大值，比CK显著增加12.8%。红大在1 mg/L Cr3+处理时幼叶GPT活性达到最大值，处理15、30 d分别比CK提高18.1%、0.4%。Cr6+处理下，随铬质量浓度增大，云烟87幼叶GPT活性逐渐降低，0.1 mg/L Cr6+处理30 d时较CK显著降低34.7%；红大幼叶GPT活性整体上则呈降低—升高—降低的趋势，在 1.0 mg/L Cr6+处理下达到峰值，但处理15、30 d仍分别较CK显著降低30.5%、13.2%。总体来看，Cr3+处理下烤烟幼叶GPT活性略高于Cr6+处理，且处理30 d高于处理15 d，红大高于云烟87。

图2 不同价态铬胁迫对烟苗叶片GPT活性的影响

2.2.2 游离氨基酸含量 由图3可以看出，不同价态铬胁迫15、30 d，2个烤烟品种幼叶游离氨基酸含量均随铬质量浓度增加而逐渐降低。除0.1 mg/L Cr3+处理2个品种和Cr6+处理15 d红大的幼叶游离氨基酸含量与CK无显著差异外，其他质量浓度Cr3+和Cr6+处理的烟叶游离氨基酸含量均显著低于CK。1.0 mg/L Cr3+胁迫15、30 d，云烟87幼叶游离氨基酸含量分别较CK降低47.5%、45.7%，红大幼叶游离氨基酸含量分别较CK降低24.8%、23.7%。1.0 mg/L Cr6+胁迫15、30 d，云烟87幼叶游离氨基酸含量分别较CK降低52.3%、46.1%，红大幼叶游离氨基酸含量分别较CK降低35.2%、38.5%。整体来看，红大幼叶内游离氨基酸含量略高于云烟87。

图3 不同价态铬胁迫对烟苗叶片游离氨基酸含量的影响

2.2.3 可溶性蛋白含量 由图4可知，Cr3+处理15 d，2个烤烟品种幼叶可溶性蛋白含量略有降低，与CK差异不显著；Cr3+处理30 d，云烟87和红大幼叶可溶性蛋白含量显著高于CK，但各胁迫处理间差异不显著，其中云烟87、红大幼叶可溶性蛋白含量分别在Cr3+质量浓度为0.1、0.5 mg/L时达到峰值，分别较CK显著增加15.5%、14.1%。Cr6+处理15 d，云烟87幼叶可溶性蛋白含量显著低于CK，而红大各处理可溶性蛋白含量与CK差异不显著；Cr6+处理30 d，云烟87和红大幼叶可溶性蛋白含量均高于CK，二者分别在0.1、0.5 mg/L Cr6+处理最高，分别较CK增加13.2%、4.6%。

图4 不同价态铬胁迫对烟苗叶片可溶性蛋白含量的影响

2.3 不同价态铬对烟草幼苗色素含量的影响

由图5可以看出，Cr3+处理15 d，云烟87的叶绿素a、b含量随铬质量浓度增加呈先减少后增加再减少趋势，类胡萝卜素含量则逐渐降低，0.5 mg/L Cr3+处理时叶绿素b含量达到最大值，较CK显著增加19.0%；而红大幼叶的叶绿素a、b和胡萝卜素含量在Cr3+胁迫15 d较CK提高。0.1～5.0 mg/L Cr3+处理30 d时，2个烤烟品种的叶绿素a和类胡萝卜素含量与CK相差不大；随铬质量浓度增加，云烟87的叶绿素b含量表现为先增加后减少，红大则表现为减少—增加—减少。Cr6+处理15 d时，云烟87的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量均显著低于CK；而红大在0.1～0.5 mg/L Cr6+处理下幼叶叶绿素a和类胡萝卜素含量较CK提高，叶绿素b含量在0.1 mg/L Cr6+处理时达到最大值。不同质量浓度Cr6+处理30 d，2个烤烟品种的叶绿素a和类胡萝卜素含量变化较小；0.1～5.0 mg/L Cr6+处理30 d，云烟87的叶绿素b含量随Cr6+质量浓度增加而逐渐降低，但均显著高于CK，而红大的叶绿素b含量则呈现增加—减少—增加的趋势。云烟87、红大的幼叶叶绿素b含量分别在0.1、0.5 mg/L Cr6+处理30 d时最高，为8.35、8.72 mg/g，分别比CK增加63.1 %、1.9%。整体来看，Cr3+和Cr6+对云烟87和红大的叶绿素b含量影响较大。随着处理时间增加，处理30 d的幼叶叶绿素a和类胡萝卜素含量高于处理15 d，而叶绿素b含量则低于处理15 d。

A、B为Cr3+处理，C、D为Cr6+处理

3 结论与讨论

氮素代谢途径中多种中间代谢产物或含氮有机物对缓解环境胁迫起着重要作用[20]。氨基酸和蛋白质是铵态氮的同化产物，它们对植株的氮代谢以及逆境胁迫下植株的抗性具有重要作用[21]。GPT在氨基酸合成和蛋白质分解代谢中起着重要的中介作用。游离氨基酸含量和GPT活性可部分反映氮转化的强度。本研究中，低质量浓度(0.1 mg/L)Cr3+处理15 d，2个烤烟品种烟叶游离氨基酸含量减少，可溶性蛋白含量也略有降低，GPT活性降低；处理30 d，游离氨基酸含量减少，可溶性蛋白含量增加，云烟87幼叶GPT活性增加而红大降低。而Cr6+处理下，GPT活性和游离氨基酸含量随铬质量浓度增加而逐渐降低，但处理30 d时各处理可溶性蛋白含量却高于CK。该结果表明，Cr3+和Cr6+胁迫能减少烟草中的游离氨基酸积累。另外，在相同铬质量浓度胁迫下，2个烤烟品种的NR、GS、GPT活性，可溶性蛋白、叶绿素a、类胡萝卜素含量，以及云烟87游离氨基酸含量均表现为处理30 d高于处理15 d，说明随着胁迫时间延长，烟苗自身生理机制逐渐完善并对铬伤害产生一定的适应性，从而提高抵抗外界伤害的能力。叶片可溶性蛋白含量增加可能是因为云烟87和红大烟苗对铬离子有一个自身适应期，在较长时间内铬能促进烟草植物细胞蛋白质的合成代谢，诱导合成更多的可溶性蛋白，参与渗透调节，提高抗逆性，这与张艳英等[18]的研究结果一致。赵全志等[22]在水稻上的研究表明，氮同化酶GS、GOGAT活性高低与叶绿素的合成及叶色变化密切相关。氮作为叶绿素分子的重要组分，对叶绿素的合成和叶绿体的发育具有重要作用。研究表明，叶绿素含量高，叶片氮代谢旺盛，叶片衰老延缓[23]。本试验研究中，低质量浓度(0.1 mg/L)Cr3+处理在短时间内增加了红大的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量；但随处理时间延长，红大的叶绿素b和类胡萝卜素含量略有降低，叶绿素a含量与CK相差不大；0.5 mg/L Cr3+处理15、30 d，云烟87的叶绿素b含量比CK显著增加，而叶绿素a和类胡萝卜素含量降低。结果表明，0.5 mg/L Cr3+能促进云烟87叶绿素b含量的积累，降低其叶绿素a和类胡萝卜素含量，这可能是因为叶绿素b对Cr3+的变化较敏感，具体原因还有待进一步探讨。另外，云烟87在0.1～0.5 mg/L Cr3+和Cr6+短时间处理下叶绿素a和类胡萝卜素含量均低于CK，而红大则大于CK，说明一定浓度铬处理一定时间下对云烟87叶绿素a和类胡萝卜素含量的影响大于红大。

从氮代谢各指标和叶绿素含量综合来看，烟苗在生长过程中，氮转化和氮同化在铬胁迫初期和低质量浓度铬胁迫下会表现出一定的增强作用，究其原因，一方面可能是逆境下的烟草通过加强代谢，激活相关保护酶系统来缓解逆境带来的伤害，另一方面可能是由于补偿效应，即植物在结构和生理水平上对阈值内的逆境胁迫条件产生一种利于作物生长发育的能力，对引起的损失具有弥补作用，是烟株对胁迫的一种本能适应性[24-26]。但随着胁迫时间延长以及铬质量浓度的增加，部分氮代谢相关指标和酶活性指标出现降低趋势，氮转化和氮同化过程受抑制，最终影响烟苗的氮代谢。

综上所述，Cr6+对烟叶氮代谢和叶绿素含量的影响大于Cr3+。在0.1～5.0 mg/L铬处理下，烤烟幼叶的GS活性、游离氨基酸含量均低于CK(无铬处理)；长时间(30 d)胁迫下，0.5 mg/L Cr3+处理云烟87的硝态氮、叶绿素b含量和NR、GS活性最高，1.0 mg/L Cr3+和Cr6+处理红大的GPT活性最高，而高浓度(5.0 mg/L)铬对2个烤烟品种氮代谢指标的抑制作用最大。铬胁迫处理30 d烤烟幼叶NR、GS、GPT活性，可溶性蛋白、叶绿素a、类胡萝卜素含量均高于处理15 d。铬对红大和云烟87叶片氮代谢相关指标的抑制作用存在差异。0.1～0.5 mg/L Cr3+和Cr6+处理15 d时，云烟87叶绿素a和类胡萝卜素含量的降低幅度大于红大，Cr6+处理下红大的NR、GS、GPT活性和硝态氮、氨基酸含量高于云烟87，且云烟87幼叶可溶性蛋白含量受Cr6+影响大于红大。因此，红大对铬胁迫的抵抗力稍强于云烟87，在今后的烟草耐性研究中可考虑选择红花大金元作为耐铬品种进行研究。