荧光成像技术在胰腺癌术中的导航作用

马涛 吕毅

西安交通大学第一附属医院肝胆外科 精准外科与再生医学国家地方联合工程研究中心，西安 710061

【提要】 胰腺癌是常见的恶性肿瘤之一，具有高度侵袭性，患者预后极差，而早期诊断、术中精准识别肿瘤原发灶及转移灶对改善患者预后极为重要。近年来荧光成像技术已应用于乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多种实体肿瘤的早期检测和术中定位以及病灶周围淋巴结、组织灌注检测等方面。本文就荧光成像技术应用于胰腺癌术中诊断及辅助治疗的相关研究进展进行探讨。

胰腺癌是常见的恶性肿瘤之一，早期症状不典型，具有高度侵袭性，患者预后极差，5年生存率不足5%，中位生存期仅6～10个月[1-3]。早期诊断、术中精准识别肿瘤原发灶及转移灶对改善患者预后、提升生存质量及延长生存时间非常重要，这也是目前胰腺癌治疗的主要目的[4-5]。分子影像学是应用影像学的方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性及定量研究[6]。荧光成像技术是基于分子影像学发展起来的较为成熟、应用广泛，在肿瘤早期诊断中发挥实时、非侵入式、特异性跟踪与探测功能的诊疗手段[7]。近些年荧光成像技术已获得临床上的认可，应用于乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌等实体肿瘤的早期检测及术中定位，同时根据荧光探针的理化特性也应用于病灶周围淋巴结、组织器官灌注检测等方面。本文介绍荧光成像技术及其在胰腺癌中的应用。

一、荧光成像技术原理

1．荧光成像基本原理：荧光成像包含靶点(靶器官)、探针及成像系统3个要素。术前通过静脉或者局部注射荧光探针，经过一段时间的生物代谢，荧光探针到达靶器官，或可与其相应的靶点结合。术中使用具有特定波长的激发光照射目标部位，产生另一波段的荧光信号，被成像系统捕获，即可实现肿瘤病灶的精准定位。每种荧光探针根据理化性质不同，其激发波长与发射波长均不相同，也就需要针对探针的成像系统进行荧光信号的激发与采集[8]。由于荧光信号都非常微弱，所以一般的成像系统还包含信号增强模块[9]。

2．临床常用荧光探针：荧光成像的核心在于荧光探针的理化性质，它决定了激发与发射波长、定位目标。目前临床上常用的荧光探针有吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)和亚甲蓝(methylene blue, MB)等[8]。ICG和MB是近红外区域的非特异性造影剂，它们不与肿瘤配体结合，但经特定器官代谢。ICG是经FDA批准的荧光染料，其激发波长为760～810 nm，发射波长在830 nm左右，处于近红外波段，具有良好的穿透深度[10]。ICG在体内的半衰期为150～180 s，血管注射后随血液循环迅速分布于全身血管内，高效率、选择地被肝细胞摄取，又从肝细胞以游离形式排泄到胆汁中，经胆管入肠，随粪便排出体外[11-13]。依据ICG的生物代谢规律可用于肝脏显影、肝脏肿瘤定位、胆道显影、血管造影等。皮下或黏膜下局部注射可经淋巴循环代谢应用于淋巴管道显影，定位前哨淋巴结。MB激发峰在700 nm 左右，主要经由肾脏代谢清除，随尿液排出，可用于泌尿系统显影及术后腔内导管的通畅及渗漏测试[12]。

二、荧光成像技术在胰腺癌诊疗中的应用

1．肿瘤及淋巴结定位：目前术前常用的影像学检查如CT、MRI等，由于体位的改变、操作者主观评估及缺乏微小病变敏感度而与术中所见存在一定的差距[14]。而荧光成像技术实时、精准的特性恰好能弥补这一不足。虽然ICG可以很容易识别肝脏肿瘤，因为其通过肝脏清除，对于腹部其他类型的实体肿瘤如胰腺等不具备特异性，但是其可以显示胰腺肿瘤周围淋巴结及肝脏微转移灶。Tummers等[15]通过荧光探针剂量递增的前瞻性研究评估了在胰腺癌手术后患者中使用西妥昔单抗-IRDye800检测胰周转移性淋巴结(lymph nodes, LNs)的可行性。研究共评估了144个LNs，其中低剂量72个，高剂量72个。结果显示在低剂量(50 mg)队列中通过荧光成像检测转移性LNs效果更好，在组织样本中灵敏度和特异度分别为100%和78%，在显微镜下分别为91%和66%。更重要的是，该方法能够检测到直径<5 mm的隐匿病灶，其灵敏度为88%(15/17 LNs)。另一方面，Yokoyama等[16]对49例术前检查未发现肝脏微转移灶的胰腺癌患者进行了术中荧光成像评估。采用术前静脉注射ICG，术中使用近红外成像系统观察肝脏及组织病理学检测异常荧光病灶的方法，在13例患者的肝脏内观察到最大直径至少1.5 mm的异常荧光信号，但肉眼却未见明显肿瘤病灶，其中8例(16%)组织学检查证实为肝脏微转移灶。术后6个月复查CT，8例肝脏微转移患者中7例(88%)发生明显的肝脏转移，而术中未发现肝脏微转移的41例患者中4例发生肝转移，差异具有统计学意义(P<0.001)。Katada等[17]的研究报道，术前检查未发现肝转移的133例胰腺癌中，术中发现肝脏微转移20例(15%)，免疫组织化学检查也提示这20例患者的转移灶癌细胞均表达CEA。由此可见，以ICG为探针代表的荧光成像可以在术中有效发现肝脏微转移病灶。

此外，胰腺的神经内分泌肿瘤，如胰岛素瘤，通常难以定位，而完全切除对于疾病治愈至关重要。 Winer等[18]将0.25～2 mg / kg体重的梯度MB注射入荷胰岛素瘤鼠体内，通过FLARE荧光成像系统观察MB检出病灶的有效性。当注射剂量≥1 mg/kg体重时，MB也会在正常胰腺组织聚集，信背比(signal-to-background ratios, SBR)≥1.6，维持荧光信号长达1 h。同时胰岛素瘤与正常胰腺组织的荧光信号比值为3.7，与肌肉的比值为16.2，可见胰岛素瘤对MB的摄取比正常胰腺组织更高。 van der Vorst等[19]报道1例神经内分泌瘤患者，术中静脉注射MB，5 min后SBR值稳定在3左右，持续15 min。胰岛素瘤能够摄取MB产生近红外荧光信号，可以在术中提供高灵敏度检测。因此基于MB的荧光成像对胰腺神经内分泌肿瘤术中定位具有一定的优势。

2．胰十二指肠切除术评估：胰十二指肠切除术是胰腺癌手术治疗最重要的术式之一，手术质量评估在患者术后转归过程中占有非常重要的地位[20]。 Hutteman等[21]对8例接受胰十二指肠切除术的患者在术中静脉注射ICG，并通过Mini-FLARE近红外荧光成像系统对胰腺、肿瘤、胆总管和周围器官进行实时成像。结果未观察到肿瘤组织与正常胰腺组织的明显荧光信号差别，但在ICG注射后10 min可清晰看到胆总管荧光显影，在注射后30～90 min之间具有最大对比度。由于胆汁持续排泄，可观察到胆管吻合的通畅性。Rho等[22]也指出，在胰十二指肠切除过程中利用荧光成像产生的视觉差可以为外科医师提供非常有效的实时荧光信号，进而指导手术。Hirono等[23]通过ICG荧光成像详细分析了胰十二指肠切除术患者的淋巴引流途径，并确定了7条主要的淋巴引流路径，用以明确胰腺癌手术淋巴结清扫范围。20例患者中4例(20%)观察到肠系膜上动脉左侧的淋巴途径，17例(85%)观察到主动脉区域，且到达肠系膜上动脉周围的平均时间比到达主动脉区域的时间更长。

三、胰腺癌荧光探针的研发

1．ICG改良探针：ICG作为经FDA批准的最常用的荧光染料之一，因其经肝脏代谢而对胰腺肿瘤原发病灶不具有特异性，限制了其应用，所以很多学者在ICG生物学特性的基础上进行优化，研发了一系列ICG改良探针。Qi等[24]将透明质酸衍生的纳米颗粒与ICG缀合形成NanoICG用于胰腺癌的术中近红外荧光检测。NanoICG对正常胰腺上皮细胞无细胞毒性，没有诱导趋化或吞噬作用，且在原位胰腺癌模型内明显聚集，使胰腺病灶的荧光强度较胰腺非病变部分显著增强，也较单纯ICG聚集胰腺病变部位的荧光强度更高。Aung等[25]将大鼠IgG2b抗组织因子(抗-TF)单克隆抗体1849(抗-TF1849)标记至ICG，合成了抗-TF 1849-ICG缀合物，通过蛋白质印迹法观察BxPC-3细胞TF表达量，结果与通过荧光显微镜观察到的优先结合1849-ICG的细胞内定位一致，说明这种1849-ICG缀合物可用于治疗高表达TF的胰腺癌，为胰腺癌治疗提供了新的策略。

2．其他新型探针：Neesse等[26]研究了花青染料(Cy5.5)标记的紧密连接蛋白-4与产气荚膜梭菌肠毒素耦联的无毒C端片段(C-CPE-Cy5.5)在胰腺癌动物模型中的定位诊断效果。通过与荧光成像方法结合，实现了紧密连接蛋白-4阳性小鼠胰腺肿瘤及其前驱病变的无创可视化，探索了一种新型的早期诊断模式。Park等[27]制备了荧光团共轭的胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)抗体，可以标记显示胰腺癌细胞膜上的荧光灶，进而实现术中胰腺肿瘤病灶的定位。 Hoogstins等[28]研发了一种新型荧光标记的抗CEA抗体，即SGM-101。术前注射SGM-101，术中发现其特异性地聚集在表达CEA的原发性肿瘤、腹膜及肝转移病灶中，原发病灶SBR为1.6，转移性病变SBR为1.7，表明使用荧光标记的抗CEA抗体对于术中检测原发性胰腺癌病灶和转移瘤是安全有效的。

四、总结和展望

荧光成像作为一种新型的诊断方法，可以使用具有高灵敏度和空间分辨率的荧光探针，使探针剂量最小化并允许实时确定组织状态[29-30]。这种方法已经在肿瘤定位诊断、前哨淋巴结显影、组织灌注等方面发挥了巨大的优势。荧光成像作为胰腺癌术中检测的新型又精准的方法，可以使恶变组织切除最大化。目前临床使用的ICG和MB分别经过肝脏或肾脏代谢，随胆汁或尿液排出体外，对于胰腺癌的诊断不具有特异性，但其能够清楚显示病灶周围淋巴结及肝微转移病灶，而且能够为胰十二指肠切除术提供一种评估方法，在一定程度上有助于胰腺癌术中诊断及治疗。尽管目前能够使用的荧光探针非常有限，且缺乏胰腺癌特异性，但随着众多学者对基于ICG耦合的探针改良和新型探针的研发，这些探针对于胰腺癌早期诊断、术中定位更具有特异性。随着荧光成像技术的不断发展，其在胰腺癌的诊断与治疗中会展现出更广阔的前景，也对提升患者预后起到积极的推动作用。

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