S100A4参与类风湿关节炎发病机制的研究进展

徐武岩，查丁胜，吴 昊，阳 华，林宏生，查振刚

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种全身性自身免疫性疾病，先天免疫系统的炎症细胞（包括单核细胞、巨噬细胞等）产生各种促炎细胞因子浸润滑膜，引起滑膜炎症。RA的标志就是滑膜增生、血管生成增加以及细胞因子和包括基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）在内的各类蛋白水解酶的上调。

S100钙结合蛋白A4（S100 calcium-binding protein,S100A4）最初从啮齿类动物肿瘤细胞中分离出来，随后在转基因动物模型中发现其过度表达与癌症进展相关[1]。最近在增殖的RA成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RAFLSs）和RA患者的滑膜组织中发现S100A4 mRNA表达增加，而RAFLSs具有以类似肿瘤的方式增殖和侵入周围组织的能力，在骨与软骨的破坏过程中发挥作用[2]。因此，学者们推测S100A4可能有助于RA滑膜发生侵袭性和类肿瘤样行为[3]。

鉴于目前RA的病因及发病机制尚不明确，预防及早期诊断几无可能。因此，寻找定期监测疾病活动及评估预后的生物标志物尤为重要，不仅为早期RA患者提供分级与个体化治疗，也为全面理解RA发病机制提供依据；有效监测疾病活动还可降低长期过度治疗的风险，这些风险包括免疫抑制药物对患者的潜在毒性、掩盖其他亚临床疾病的进展等。本文旨在综述S100A4参与RA发病机制的相关研究进展，以期为RA的早期预防、诊断、治疗及特异性药物的开发提供参考。

1 S100A4的生物学功能

S100蛋白是一个酸性Ca2+结合蛋白家族，包含20多个成员。其与钙离子结合后蛋白构象发生改变，暴露出与靶蛋白结合的位点，进而通过相应的靶蛋白发挥其生物学效应。S100蛋白参与调节多种生物功能，胞内功能包括钙稳态调节、蛋白磷酸化、细胞骨架重排、转录活性调控以及通过各种模式识别受体诱发炎性反应；胞外功能则是通过晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGEs）及 toll样受体 4（toll-like receptor 4，TLR4）调节细胞的增殖、活化及凋亡[4]。

S100A4是低分子量（9-13kDa）的S100蛋白家族成员之一，在癌症发展中的作用目前被广泛研究，其与病变转移灶的紧密结合有力证实了该蛋白与癌细胞迁移的相关性[5]。多种人类肿瘤表达S100A4，这对癌症患者的分期和预后具有潜在的预测价值[6]。Chen等[7]研究发现S100A4在不同病理类型的肺癌中都有过度表达，而抑制非小细胞肺癌中S100A4表达后可明显降低肿瘤细胞的增殖速度及侵袭能力，推测S100A4可通过调节肿瘤细胞增殖来控制肺癌发展。Destek和Gul[8]对148例结直肠癌患者的病理切片进行免疫组化分析，结果发现，其中132例（89%）患者S100A4表达阳性，细胞质S100A4的表达水平与结直肠癌TNM分期以及患者的存活率显著相关。亦有学者指出，S100A4与多种细胞内靶蛋白如细胞骨架成分、E-钙黏蛋白、p53及MMPs的调节有关，它们共同构成病灶转移的分子基础，这也进一步揭示了S100A4在细胞运动、黏附、分离、增殖和凋亡中的作用；与此同时，该蛋白还参与细胞外基质的血管生成和重塑，通过对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的活化直接促进血管生成，加速滑膜血管翳的形成[9]。

2 体外研究揭示S100A4参与RA发生发展的分子机制

诸多体外研究从分子水平揭示，S100A4可通过参与刺激细胞增殖、调节细胞凋亡和组织重塑以及促进血管翳形成过程，引起RA炎症和组织破坏，加速RA的发生发展。

2.1 S100A4与细胞凋亡、炎症反应

有学者认为，细胞外S100A4可稳定RAFLSs中的p53肿瘤抑制因子，调节其转录激活并影响p53靶向基因（包括Bcl-2、p21WAF和Hdm-2）以及MMPs的表达，而S100A4蛋白与野生型p53蛋白的螯合，可加速野生型p53功能的丧失，以致细胞周期失去调控，抑制细胞凋亡[10]。Cerezo等[11]的研究亦证实，S100A4通过刺激外周血单核细胞，显著提高白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和TNF-α的表达，进而诱导单核细胞中TLR4介导的炎症反应，激活转录因子（nuclear factor，NF）-κB、细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）1/2和p38；S100A4多聚体（活性形式）还可刺激滑膜成纤维细胞，参与细胞凋亡的调节过程。这些结果均支持S100A4参与激活免疫介导的疾病（如RA）中的免疫应答和炎症反应的假设。

2.2 S100A4与细胞增殖、基质降解

细胞异常增殖目前被认为是RA滑膜生长的主要机制。RAFLSs具有转化细胞的特征，在连续培养中表现出高增殖率、接触抑制缺失、组成性表达细胞因子mRNA和锚定非依赖性细胞生长等一些新特性[12]。有实验证实p53基因在滑膜中的累积及其对RAFLSs增殖调控的重要作用[13]；Grigorian等[14]进一步指出，S100A4蛋白可与p53蛋白C终端调控区结合，通过蛋白激酶C的作用抑制p53蛋白磷酸化，从而使p53蛋白丧失细胞周期调控作用及其在G1/S期的检查点功能，令DNA易发生突变的细胞进入S期，引起RAFLSs的侵袭性生长。亦有研究发现，S100A4可能通过与细胞内靶蛋白如肿瘤抑制因子p53的相互作用引发级联反应，进而参与RAFLSs的侵袭性生长过程。柏干苹等[15]、Bo等[16]应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离RA患者和正常人RAFLSs中的差异蛋白，成功鉴定异常表达的S100A4，并用Western Blot免疫细胞化学技术再次验证；光镜下正常成纤维样滑膜细胞中的S100A4只在细胞浆表达，但在RAFLSs中其分布发生变化，细胞浆和细胞核均可见荧光分布，且细胞核中明显较多，提示S100A4在RAFLSs中高表达，且与RAFLSs表型改变及其侵袭性生长密切相关。Schmidt-Hansen等[17]的研究亦发现，胞外S100A4可促进小鼠内皮细胞中p53的表达，影响包括MMPs在内的p53靶向基因的调节，导致抑制剂E-钙黏蛋白表达下调，无法正常介导同型细胞间的黏附，进而刺激小鼠内皮细胞的浸润性生长。此外，S100A4还可刺激原癌基因PIM-1在RAFLSs高表达，而PIM-1是某些非血液肿瘤细胞增殖和侵袭的主要调节因子，这也是RAFLSs具有高度侵袭性的重要原因[18]。

细胞外基质的降解是细胞侵袭和转移的关键环节，MMPs可通过降解细胞外基质中的各种蛋白成分来破坏组织学屏障。S100A4通过与人类软骨细胞中的活化NF-κB相结合，激活RAGEs通路，增强 MMP-13 的表达[19]；Senolt等[20]的研究结果则表明，S100A4可促进炎症细胞因子（IL-1β、TNF-α等）在RAFLSs中表达并触发细胞内外信号通路，上调MMP-3 mRNA，诱导MMP-3蛋白的释放，MMP-1、MMP-9和MMP-13 mRNA在滑膜中的表达也同时上调。而鉴于MMPs对RA关节明显的破坏作用，学者们认为S100A4参与了包括血管翳形成和关节软骨破坏等在内的RA发病机制。

2.3 S100A4与新生血管形成

新生血管形成被认为是生成和维持RA血管翳的一个重要因素，而VEGF是新生血管形成的关键调控因素[21]，也是RA发病过程中的直接促炎细胞因子。Hernández等[22]研究发现，S100A4通过RAGEs与VEGF协同作用，增强MMP-9活性，促进内皮细胞迁移；而阻断由S100A4和VEGF结合诱导的内皮细胞迁移后，血管生成被有效抑制。在我们的体外细胞模型实验中，S100A4可通过mTORC1信号通路下游蛋白S6信号通路途径，增强RAFLSs中VEGF的活性及蛋白表达，间接促进S100A4在体外形成血管的作用[23]。

3 在体研究证实S100A4在RA发生发展中扮演重要角色

构建动物模型在RA研究中是不可或缺的手段。目前关节炎动物模型的构建技术已相对成熟，应用最广泛的动物模型包括Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型和佐剂诱导的关节炎模型等，是研究RA发病机制的良好媒介。

柏干苹等[24]报道，注射S100A4 siRNA后佐剂性关节炎模型大鼠（模型干扰组）关节炎性肿胀明显改善，关节炎指数明显降低，炎性细胞浸润及滑膜增生现象减轻，血清TNF-α、IL-1β和VEGF表达水平低于模型组，关节滑膜的病理损伤明显减轻，这一结果提示S100A4在滑膜异常增殖及关节炎症进展中可能发挥重要作用。

在Nishioku等[25]的研究中，通过构建Ⅱ型胶原诱导的CIA小鼠模型，作者发现S100A4借助p53来下调紧密结合蛋白occludin的表达水平，增加小鼠RAFLSs的细胞旁通透性，这也部分解释了RAFLSs高度侵袭性的原因。也有学者在缺乏S100A4蛋白（S100A4KO）的甲基化牛血清白蛋白（methylated bovine serum albumin，mBSA）免疫小鼠以及用靶向S100A4-shRNA构建体处理的野生型对照小鼠中诱导关节炎，并对关节炎的严重程度进行形态学评估，结果表明，S100A4KO小鼠关节炎和关节损伤的形态学征象明显减轻；进一步的体外实验显示S100A4可直接结合Src家族中的Lck和Fyn，并增强它们在CD5细胞结构域的激酶活性，进而控制Th17细胞的CD5依赖性分化，从而在关节炎的发病机制中发挥重要作用[26]。总之，这些研究结果进一步证实S100A4参与了高度侵袭性的RAFLSs的异常增殖，而抑制S100A4的功能和表达对RA有一定的治疗效果。

4 S100A4异常表达在RA临床研究中具有重要价值

4.1 预测RA患者疾病转归和疗效的有效指标

由于S100A4水平与治疗效果关系密切，因此有望成为评估RA患者预后的指标之一[27]。Erlandsson等[28]根据血清S100A4水平将87例RA患者分为3组，对比影像学表现、Flt3配体含量及疾病转归后发现，S100A4水平与RA患者影像学损害程度相关，高水平表达的S100A4会导致英夫利昔单抗治疗效果不佳；进一步剔除年龄、性别、病程等混杂因素后，S100A4水平与缓解率仍呈负相关；同时，S100A4水平与原癌基因survivin、Flt3配体水平也密切相关，提示3种蛋白可能共同构成一个预测RA的生物标记物。在Ha等[18]的研究中，S100A4水平与原癌基因PIM-1水平呈正相关，而PIM-1减少可有效抑制RAFLSs的体外增殖、迁移以及MMPs的产生，有效改善患者预后，这也预示着低水平S100A4的RA患者可能预后更好。

4.2 评估RA患者疾病活动程度的生物学标志

TNF-α抑制剂英夫利昔单抗是缓解RA的有效方法之一[29]。Oslejsková等[30]在40例抗TNF-α初治RA患者中随机选取25例给予阿达木单抗治疗，治疗12周后患者疾病活动度明显降低，S100A4的构象从多聚体形式变为二聚体形式，但蛋白总水平保持不变，由于多聚体被认为具有生物活性，因此推测生物活性S100A4蛋白（多聚体）的下调可能与TNF-α阻断治疗后疾病活动性降低有关。多聚体形式有利于S100A4蛋白表面钙离子结合位点的显露以及同其他功能蛋白之间的相互作用，以多聚体形式存在于细胞间质中的S100A4蛋白正是细胞之间信号传导，细胞与细胞基质相互联系、相互作用的基础。Klingelhöfer等[10]也发现，RA和OA患者的胞外S100A4以不同构象形式存在，RA患者的大部分胞外S100A4以多聚体形式存在，OA患者则大部分为S100A4二聚体，这与Oslejsková等[30]的研究结果相一致。为证实S100A4水平与疾病活动性的相关关系，有学者检测早期RA组和健康对照组的S100A4水平，多变量回归分析结果表明，早期RA组血清S100A4水平显著高于健康对照组，治疗3个月后明显降低[31]。可见，通过检测S100A4水平及其存在形式，可以有效判断RA的活动程度。

4.3 其他作用

我们的前期研究发现，S100A4蛋白在RA患者膝关节滑膜中高表达，体外可促进RAFLSs分泌VEGF刺激滑膜血管生成，间接促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）形成管腔，这一结果提示S100A4可能是RA患者滑膜组织炎症反复发作的一种新的致病因素[32]。其作用机制可能是，S100A4蛋白被表皮生长因子、成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等胞外生长因子激活后，促进了MMPs的表达和活化，而包括纤溶酶和MMPs在内的水解蛋白酶又可释放细胞外基质中的TGF-β前体蛋白和FGF并进行活化，从而使S100A4表达水平进一步上调，由此建立一个正反馈调节机制，导致RA患者炎症反复发作。

5 小结

目前有关肿瘤细胞侵袭和转移机制的研究已有很大进展，普遍认为是通过蛋白质与多种效应物的相互作用激活了信号通路，调节细胞外基质的分离、黏附、运动、血管生成、细胞增殖和凋亡，进而增强了肿瘤细胞的侵袭性，促进肿瘤转移。无独有偶，肿瘤细胞的转移特征与RAFLSs在RA中的侵袭行为类似[33-34]。当前的体外研究和在体实验结果证实，S100A4蛋白可稳定RAFLSs中的p53肿瘤抑制因子，调节其转录激活并影响p53靶向基因以及MMPs的释放。一旦释放至胞外，S100A4还可作为促炎因子，通过模式识别受体作用于炎症部位，影响炎症因子的分泌，参与调节细胞凋亡、组织重塑及刺激细胞增殖，进而导致RA炎症、滑膜增生和组织破坏；S100A4还可通过增加VEGF表达来促进新生血管生成，参与滑膜血管翳的发生。临床研究方面，S100A4在RA患者的滑膜组织和体液中高表达，其血清水平及构象与RA发生发展密切相关。这些临床证据提示，尽管S100A4没有明确的RA特异性，但其与全身炎症、RAFLSs活化相关，是预测患者预后转归、疾病活动程度的有效指标。基于S100A4在RA发生发展过程中的重要作用，人们开展了相关干扰药物的临床试验研究，包括抑制S100A4的表达和分泌、阻断S100A4受体相互作用及通过S100A4诱导先天免疫耐受等等，为RA的治疗提供了新的选择，但目前尚处在临床试验阶段。

总之，S100A4异常表达与RA的发生发展密切相关，但其介导RA的分子机制尚未完全明确，这就需要围绕参与RA的关键细胞，进一步探讨S100A4发挥作用的分子机制；而作为监测RA疾病活动的生物标志物之一，未来仍需全面探索S100A4在RA中的作用，对其功能模式进行深入研究，以寻找运用先天性和适应性免疫机制治疗RA的新分子靶点。