兽用博落回散对常用益生菌生长的影响

■张少航 巫 攀 王启军 凌华云 蒋思婧* 张桂敏

（1.湖北大学生命科学院，湖北武汉430062；2.湖北华扬科技发展有限公司，湖北武汉438899）

博落回（Macleaya cordata）属罂粟科多年生大型草本植物，又名落回、号简草等，为野生有毒植物。博落回提取物和博落回散已被列为我国的二类新兽药（农业部公告第1597号，新兽药注册目录），用于杀虫和抑制肠道有害微生物。欧阳龙等的研究表明，猪每天给予小于5 mg/kg体重的博落回散是安全的；博落回提取物——血根碱在1999年被收入《饲料添加剂品种目录》（农业部公告195号），在此基础上，一些研究小组进行了博落回散作为添加剂的饲喂研究。蔡鹏等的研究表明博落回散作为饲料添加剂，以15～24 mg/kg的剂量添加于断奶的仔猪饲料中，有效的提高了仔猪的日采食量和日增重量，这表明小剂量的博落回散可以作为饲料添加剂使用。

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可以平衡肠道微生物，减少有害微生物的定植。因此，益生菌可以作为优良的饲料添加剂添加到畜禽饲料中，而饲料经益生菌发酵后，不仅提高了饲料的利用率，而且发酵过程中还会产生多种维生素、活性小肽、氨基酸以及多种酶类等，可以促进禽畜的营养代谢，提高动物的生产性能和饲料的营养价值。

博落回散作为饲料添加剂，能有效地预防畜禽感染性疾病的发生，促进动物的健康生长。而益生菌添加于饲料中，不仅能提高动物对饲料的利用率、补充多种营养物质，还能抑制肠道腐败菌的生长。如果这两类饲料添加剂能同时使用，不仅能预防疾病和平衡肠道微生物的生态环境，还能提高饲料的转化率和养殖业的产出，降低生产成本。但博落回散是否会影响饲料中益生菌的生长和正常的代谢？目前未见任何相关的研究报道。本文拟通过博落回散对饲料益生菌的抑制作用以及最小抑菌浓度分析，获得博落回散与益生菌作为饲料添加剂同时添加使用的实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药品

博落回散（湖南美可达生物资源有限公司）、MS培养基（北京陆桥集团有限公司，CM 188）、Tryptone（OXOID）、Yeast Extract（OXOID）、NaCl（中国医药集团有限公司）、Agar（Biosharp）等。

1.1.2 实验菌株

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜热乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），实验所用菌株均为本实验室分离保藏。

1.1.3 实验培养基

LB培养基：蛋白胨10.0 g、酵母浸出粉5.0 g、NaCl 10.0 g、去离子水1 L，固体培养基中加入1.0%～1.5%的琼脂。

MS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温1.0 ml、七水合磷酸氢二钾2.0 g、三水合乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、七水合硫酸镁0.2 g、四水合硫酸锰0.05 g，加入去离子水1 L，固体培养基中加入1.5%的琼脂。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度的博落回散溶液的制备

称取500 mg的博落回散溶于50 ml的无菌水中，配置成10 mg/ml的博落回散母液，按照比例分别稀释成1、2、3、4、5、6 mg/ml的实验所用博落回散溶液。将其储存至4℃冰箱备用。

1.2.2 菌株的活化

将实验室保存在-80℃的菌株置于冰上缓慢融化，其中鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌分别划线于MS固体培养基上，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌划线于LB固体培养基上，置于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落，分别接种于对应的MS液体培养基和LB液体培养基中，37℃震荡培养18 h，备用。

1.2.3 博落回散抑菌实验

平板抑菌圈实验：分别吸取培养好的5 μl九种菌的菌悬液，与20 ml的固体培养基混合均匀后倒平板。待平板凝固后，每块平板分别放入7个无菌牛津杯，向牛津杯中分别加入1～6 mg/ml的博落回散溶液，以加入等量无菌水作为对照，将标记好的平板置于37℃的培养箱中培养18 h，观察抑菌圈的大小并测量博落回散浓度为6 mg/ml时抑菌圈的直径，每次实验重复3次。

最低抑菌浓度（MIC）测定：分别取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热乳杆菌5 μl的菌悬液，加入到5 ml的LB液体培养基或MS液体培养基中，向其中加入4 mg/ml的博落回散溶液 100、200、300 μl，用无菌水补至总体积一样。鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的菌悬液5 μl加入到5 ml的MS液体培养基中向其中加入10 mg/ml的博落回散溶液200、300、400 μl，用无菌水补至总体积一样。同样的方法将植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌接种后加入10 mg/ml的博落回散溶液400、500、600 μl，用无菌水补至总体积一样。将所有试管置于37℃的摇床中培养18 h，观察菌体生长情况。

2 结果

2.1 平板抑菌圈实验结果

2.1.1 不同终浓度的博落回散溶液对9种菌的抑菌效果

不同终浓度的博落回散溶液对9种益生菌的生长产生了不同的抑菌效果（图1）。从图1中可以看出不同终浓度的博落回散溶液对同一种菌的抑制作用有明显的差异。博落回散溶液的终浓度越高抑菌圈越明显。此外，相同终浓度的博落回散溶液对不同种属的益生菌的抑制效果也有明显不同，抑菌圈直径差异较大。当博落回散终浓度为1 mg/ml时明显的抑制了地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热乳杆菌的生长，当博落回终浓度为3 mg/ml时，才会对鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌的生长产生明显的抑制作用，这说明地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热乳杆菌对博落回散溶液比较敏感。

图1 不同浓度的博落回溶液对9种益生菌的抑制作用及抑菌圈的大小

2.1.2 抑菌圈直径的测定

从抑菌平板可以看出，相同终浓度的博落回散溶液对不同种属的益生菌产生的抑菌圈直径会有明显的差别，通过抑菌圈直径的大小可以直观比较出6 mg/ml的博落回散溶液对九种益生菌抑制的程度。由测量可知6 mg/ml的博落回溶液对嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的抑菌圈直径平均值分别为为9.6、10.3、15.0、10.0、6.3、11.5、11.3、21.0、21.0 mm，6 mg/ml的博落回溶液对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的抑制作用最强，对植物乳杆菌的抑制作用最弱（图2）。

图2 6 mg/ml的博落回对不同种的益生菌抑菌圈直径的大小

2.2 最小抑菌浓度的测定

通过最小抑菌浓度实验分析博落回散溶液对不同种属的益生菌的最小抑菌浓度（表1）。从表1可以看出地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热乳杆菌的最小抑菌浓度为150 μg/ml，干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的最小抑菌浓度为580 μg/ml，鼠李糖乳杆菌的最小抑菌浓度为720 μg/ml，屎肠球菌、粪肠球菌的最小抑菌浓度为900 μg/ml，植物乳杆菌的最小抑菌浓度为1 080 μg/ml。此结果与平板抑菌直径测量结果是吻合的，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌对博落回散溶液最敏感，其抑菌直径是最大的。植物乳杆菌对博落回散溶液不是十分敏感，其抑菌圈直径也最小。

表1 博落回溶液对所选的9种益生菌的最小抑菌浓度（MIC，x=∑xi/n，n=3）

3 讨论

随着世界范围内对抗生素滥用的重视以及禁止抗生素用作饲料添加剂，寻找具有天然抗菌活性且安全无污染的绿色饲料添加剂成为研究的重点。博落回散作为天然的抗菌剂越来越多的运用于禽畜的饲养中，大量研究表明博落回散作为饲料添加剂不仅有抗炎的作用[11]，而且可以提高母猪的日采食量和窝产仔数，降低仔猪的腹泻率[12]；Khadem等研究表明在饮用水中添加博落回提取物可以降低肉鸡的腹脂率以达到提高肉鸡的品质的目的。博落回散中的生物碱（包含血根碱和白屈菜红碱等）是主要的抑菌活性成分，Li等研究表明博落回散中的血根碱（Sanguinarine）、白屈菜红碱（Chelerythrine）具有抗菌杀菌活性，现代药理研究表明博落回散作为兽药具有消炎、抗癌的功效。

用益生菌发酵饲料已成为饲料行业的通用手段，益生菌发酵的饲料对维持禽畜的肠道菌群的平衡和生产性能方面有着显著的增益作用。刘金萍等[16]研究表明益生菌发酵饲料对于仔猪肠道大肠杆菌有着明显的抑制作用，对肠道益生菌起到了促进作用；邓敦等报道显示用乳酸菌发酵的饲料喂养仔猪能明显提高仔猪的免疫力，提高仔猪的抗病能力。此外，益生菌发酵的饲料不仅可以提高饲料的利用率，且作为功能饲料适口性强，动物喜食。

饲料中添加益生菌已为养殖行业普遍接受，博落回散作为饲料添加剂尚在推广过程中，这两者能否同时使用呢？本研究旨在寻找博落回散的使用浓度和9种益生菌之间的协调互作的比例关系，研究结果表明：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热乳杆菌对博落回散最敏感，最小抑菌浓度为150 μg/ml，这个数值是博落回散作为饲料添加剂建议使用的终浓度（60 μg/ml）的2.5倍，而其他几种菌的最小抑菌浓度更高；这说明博落回散溶液在规定的使用范围内（30～60 μg/ml）不会对常用的益生菌产生抑制作用。

本研究首次分析了博落回散溶液对常用饲料益生菌生长的影响，在推广使用博落回散饲料添加剂方面提供了有力的支持，这对养殖业的健康发展也有积极的推动作用。