应用XAFS研究十二指肠中锌的相对浓度和状态

■隋美霞 海 风 王宗伟 王汉海

(1.潍坊学院山东省生物化学与分子生物学重点实验室，山东潍坊261061；2.沈阳鸟岛管理有限公司，辽宁沈阳110000；3.山东省寿光市畜牧兽医管理局，山东寿光262700）

Zn元素因具有广泛的生理生化功能而被称为机体的“生命元素”，同时也是必需的微量元素之一。然而，不同状态锌源锌在机体内的生物利用率有显著差异。目前，生物制品中的Zn大多停留在应用原子吸收光谱进行锌的含量研究[1]，并未涉及到其结构，X射线吸收精细结构（X-ray absorption fine structure，XAFS）技术不只是局限于结晶物质结构和物质电子结构的研究，还可研究吸收原子的几何结构和化合态。此外，XAFS技术能检测出与该微量元素相临界元素的氧化状态。目前，对Zn元素的研究主要集于饲养试验，大多数是对日粮中添加不同状态锌源的效果进行了报道，但对其在反刍动物十二指肠内的吸收特点及消化机理研究甚少，主要原因是缺乏有效的测定方法。本试验目的是应用XAFS探讨外翻肠囊试验条件下，不同状态的锌源锌经绵羊十二指肠肠囊吸收后浓度及状态变化。探索XAFS技术在动物营养研究中Zn的应用，并为反刍动物不同状态锌源的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同状态锌源锌标准品:氧化锌，ZnO含量≥95.00%，Zn含量76.75%；硫酸锌，ZnSO4含量≥97.00%，Zn含量35.55%；蛋氨酸锌，ZnMet含量≥81.50%，Zn含量18.97%；赖氨酸锌，ZnLys含量≥28.00%，Zn含量5.31%。

在上海光源XAFS试验站进行Zn元素的XAFS谱测定，其中，电子能量为800 MeV，平均电流强度为105.6 mA。

1.2 试验设计

选取体格健壮、体重相近的18头绵羊作为十二指肠的供体动物，禁食12 h，屠宰，立即分离出10 cm长的十二指肠中段，用39～40℃的生理盐水冲洗，参照Seal等[2]所述方法，制成外翻肠囊，立即投入盛有20 ml按试验处理安排配制的不同形态锌培养液的培养瓶中，向瓶内充入95%O2和5%CO2后，密闭条件下40℃水浴振荡培养(100 r/min)40 min[3]，整个过程不应超过15 min（保证肠段具有正常的生理机能）。按等量锌在上述处理中加入6种不同锌源（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys）。培养结束后，肠段用生理盐水反复冲洗，65℃干燥24 h，待用。同步辐射装置上测定Zn的XAFS谱，同时测定锌源标准品（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys）的XAFS谱。

1.3 数据处理

试验所得数据应用 origin（6.1）软件整理后，同时进行归一化分析。

2 结果与分析

2.1 不同锌源标准品的XAFS谱

饲料级标准品锌源的K边XAFS谱见图1。

在XAFS图谱中，Zn的K边吸收值为9 659 eV，总能量范围在100 eV内。通过图谱可以看出，四种锌源标准品的XAFS谱吸收值差距明显，两种无机锌较两种有机锌的K边吸收值显著增大。ZnO与另外三种锌源不同点主要表现为，其在主吸收峰的低结合能一侧有肩峰，表明样品中饲料级ZnO中的Zn可能存在两种或两种以上的不同化学状态，但其主化学状态为ZnO；此外，局域结构也有所不同，这可能是锌周围氧原子数目不同导致形成的。其它三种锌源谱线表明基本只有一种化学状态。由以上谱线显示的能量和局域结构可以看出，Zn在这四种标准品中的结构存在显著差异。

图1 四种标准品锌的K边XAFS谱线

2.2 十二指肠肠囊中不同锌源的浓度和结构变化

十二指肠肠囊中四种锌源（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys）的K边XAFS谱线见图2。

图2 十二指肠肠囊中不同锌源的K边XAFS谱线

由图2可以看出，经过密闭震荡培养40 min后，ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys四种锌源的谱线基本相同，但有机锌组（ZnMet、ZnLys）相对浓度明显优于无机锌组（ZnO、ZnSO4），ZnMet突变最大，ZnO突变最小，即十二指肠壁中ZnMet组锌浓度最高，ZnO组锌浓度最低，这说明在十二指肠体外培养过程中有机锌较易吸收。此外，从该图中也可以看出有机锌较无机锌K边吸收值较小，但四种锌源吸收峰后的曲线形状非常相似，说明经过体外培养十二指肠壁中Zn的化学状态相同。

十二指肠肠囊中不同锌源（ZnSO4、ZnMet、ZnLys、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys）的K边XAFS谱线见图3。

图3 十二指肠肠囊中不同锌源的K边XAFS谱线

由图3可以看出，经过密闭震荡培养40 min后，这5种锌源的谱线基本相同，吸收峰后的曲线形状非常相似，说明经过体外培养十二指肠肠囊中Zn的化学状态相同，但是其相对浓度却发生了明显变化，顺序 依 次 为 ZnSO4+Met＜ZnSO4+Lys＜ZnSO4＜ZnLys＜ZnMet。

ZnSO4、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys三种锌源来说，ZnSO4的突变最大，其相对浓度相对最高，而ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys这两组差别不大，说明虽然在ZnSO4中添加了蛋氨酸和赖氨酸，但在吸收过程中，这两种游离氨基酸并未促进锌元素的吸收，反而抑制其吸收。

对于 ZnSO4、ZnMet、ZnSO4+Met三种锌源来说，ZnMet的突变最大，其相对浓度相对最高，其次是Zn-SO4，最后是ZnSO4+Met，说明有机锌较易被吸收，添加蛋氨酸抑制锌元素的吸收，但是其结构均相同。Zn-SO4、ZnLys、ZnSO4+Lys三种锌源的吸收情况与ZnSO4、ZnMet、ZnSO4+Met的相似。

3 讨论

3.1 XAFS技术测定元素的优越性

同步辐射XAFS技术除了能够定性定量检测大多数的微量元素，且能研究吸收原子的几何结构和化合态，鉴于此，XAFS技术将是生命科学研究的重要手段[4]。但目前XAFS技术在生物样品中的应用较少，仅有少量研究报道了应用Synchrotron radiation评定饲料中的微量元素[5]，但试验结果显示，XAFS谱峰值对不同元素的价态均极为敏感，不同价态微量元素的XAFS谱可以很好被分开。

3.2 外翻肠囊技术在动物试验中的优越性

外翻肠囊技术即从屠宰的动物活体立即取出小肠后分割，将各片段外翻结扎，向囊状物中注入特定的培养液（不含待测物质），立即将其放入特定的含有待检测物质的培养液中，通过检测肠囊中待检测物质的含量及状态变化，从而明确元素吸收情况[6]。Evans[7]采用该方法研究了大鼠整段小肠Zn元素的最佳吸收部位，认为外翻肠囊法是目前有效的研究微量元素吸收的方法。

3.3 十二指肠肠囊Zn的相对浓度和状态变化

该试验结果可看出，在外翻肠囊试验条件下，十二指肠中有机锌较无机锌更容易被吸收。Ashmead等[8]的研究结果显示，大鼠分离不同肠段对有机铜的吸收率是无机铜的4倍，这与本试验所得结果一致。但是Hill等[9]利用大鼠十二指肠外翻肠囊技术结果显示，三种锌源（氯化锌、蛋氨酸锌、赖氨酸锌）中Zn元素在培养后液体中的出现率并无显著差异，表明有机锌和无机锌的生物学活性相似。这与本试验结果有较大差异，出现上述结果不一致的原因可能与试验方法、所用试验动物的种类、所处的生理状态不同有关。

本试验在无机锌中添加游离氨基酸，非但没有促进锌元素的吸收，反而抑制其吸收。计峰[10]通过外翻肠囊方法研究结果表明，无机锰与两种氨基酸（甘氨酸、蛋氨酸）混合物的吸收率都比单一无机锰的吸收率要小，这与本试验结果一致。Wapnir等[11]研究结果表明，较小分子量配体从某种程度上可以络合Zn，从而达到防止Zn元素在生理pH值条件下生成沉淀的效果，因而可促进Zn元素的吸收，且当配体与锌的比例小于或等于3∶1时作用最有效，此结论被过量组氨酸可竞争性抑制组氨酸锌的吸收所证实。Bonewitz[12]认为，小分子量配体的作用是使饲粮中的锌更易吸收，而不是锌转运体系中不可缺少的组成成分。本试验中添加蛋氨酸及赖氨酸，可能是由于添加过量，过量的蛋氨酸及赖氨酸竞争性地抑制了锌元素的吸收，所以锌的吸收相对减少。

国内外学者研究结果显示，大鼠肠道对Zn元素的吸收包含两个基本过程，即饱和载体调节及非饱和扩散[13-16]。Hempe等[17]认为，这种现象表明Zn元素在机体肠道内的吸收可分为跨细胞吸收和细胞间扩散两大类。本试验通过外翻肠囊技术研究绵羊十二指肠对不同状态Zn的吸收，其中四种标准品中Zn的状态不相同，所处环境亦不同，但经过绵羊十二指肠吸收后，四种结构状态反而相差不大，极为相似，这说明有机锌的吸收途径可能与无机锌的相似，即从吸收机理而言，有机锌与无机锌一样，即通过不依赖于载体调节的非饱和扩散形式被机体吸收的，有机锌首先解离成离子，然后通过无机锌的吸收途径被机体肠道所吸收。于昱[18]通过试验结果提出了有机锌与无机锌的吸收途径相似的假设，本试验结果确定了于昱提出的有机锌的吸收假说，本试验采用XAFS技术检测十二指肠肠囊锌元素的吸收状态，较于昱方法更为成熟，样品处理更简便，而且试验误差很小。

4 结论

本试验应用先进的XAFS技术，样品制备过程简易，测定结果更为准确，但影响因素相对较少。此外，通过外翻肠囊技术研究机体肠段对不同状态Zn的吸收，试验结果显示有机锌优于无机锌，有机锌更易被吸收，确定十二指肠肠道中有机锌的吸收机理与无机锌的相同。此外，本试验结果显示，无机锌与配体蛋氨酸及赖氨酸的结合反而抑制了锌元素的吸收，这可能与无机锌与配体比例有关，有必要开展进一步研究。但本试验是在外翻肠囊的试验条件下测定的，有必要进一步开展体内试验加以验证，在既不影响动物营养需要，又能提高锌的吸收及利用率的前提下，应用适宜廉价的锌添加剂，从而降低饲养成本。