复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能、腹泻率和营养物质消化率的影响

2019-01-02宋献艺周胜花

饲料工业 2018年15期

■宋献艺刘洋周胜花

(1.山西省农业科学院饲料兽药研究所，山西太原030000；2.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032)

抗生素在动物生产中的广泛使用，能够提高动物生长性能，提高动物抗病能力，但是，抗生素在动物机体残留，污染环境等严重问题日益突出[1]，禁抗的趋势亟不可待，开发替抗产品是时代所需。益生菌具有能够提高营养物质消化率、生长性能、免疫力、降低腹泻率等优点[2-5]，因此是一种重要的替代抗生素产品。益生菌的来源有很多种，可以通过体外试验筛选同源益生菌及其复合物。Liu等[6]研究表明，添加干酪乳杆菌和肠球菌饲喂断奶仔猪后能够提高断奶仔猪生长性能和免疫能力，维持肠道平衡，降低死亡率和腹泻率。Jørgensen等[7]研究表明，添加400 mg/kg芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）能够提高断奶仔猪生长性能和营养物质表观消化率。Deng等[8]研究表明，枯草芽孢杆菌RJGP16和唾液乳杆菌B1具有协同作用，能够增强肠道免疫力。仇武松等[9]研究表明，添加产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌均能提高湖羊饲料转化效率并可提高蛋白质消化率，枯草芽孢杆菌的效果明显优于产朊假丝酵母。但Tanja等[10]研究表明，添加乳酸菌对生长性能和肠道形态并没有显著影响。目前关于益生菌制剂的应用以单一菌种研究为主，多种益生菌联合对动物的研究相对较少，本试验旨在研究复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能、腹泻率和营养物质消化率的影响，为复合益生菌制剂的开发与利用提供一定的技术指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

营养肉汤培养基购自北京奥博星生物技术公司；MRS液体培养基、生化鉴定所用全部试剂均为青岛海博生物科技有限公司产品；PCR试剂盒、胶回收试剂盒等为Invitrogen公司产品。

1.2 试验动物

在山西农业大学动物科技学院实验基地选择6头断奶后1周（28日龄）的饲料中没有添加抗生素的健康仔猪。

1.3 复合益生菌制剂

复合益生菌制剂为本课题组自行研发，内含乳酸菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母，总有效活菌数大于1010cfu/g。

1.4 试验动物及设计

选用28日龄断奶健康杜×长×大三元仔猪80头（由山西广联畜禽有限公司种猪场提供），随机分成试验组和对照组，每个组设2个重复，每个重复20头猪，分别添加0.1%复合益生菌制剂的试验组和基础日粮对照组。试验进行28 d。

1.5 基础日粮组成及营养水平

基础日粮为玉米-豆粕型为基础日粮，粉料，营养需要参照山西广联畜禽饲料有限公司企业标准Q/140000SXGL01-2013设计，日粮组成及营养水平见表1。

1.6 饲喂管理

饲养试验在山西广联畜禽有限公司种猪场进行，每天8:00、13:00、19:00饲喂猪群，自由饮水，每次饲喂直至料槽剩余少许饲料为止，并记录采食量，按常规免疫程序接种和饲养管理。

1.7 测定指标

1.7.1 菌体形态学检查

纯培养后直接观察其菌落形态，然后并进行革兰氏染色和孔雀绿染色，在显微镜下观察细菌菌体形态。

1.7.2 16S rRNA序列分析

分离的每株菌采用珠磨法[8]提取总DNA。培养液0.2 ml与1 ml TN150（Tris-NaCl buffer）和150 μl水饱和酚混合，在珠磨仪（Mini-Bead Beater，Biospec，USA）上5 000 r/min珠磨3 min破碎样品。经三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris]饱和酚和氯仿/异戊醇反复抽提，用乙醇沉淀DNA，适量TE缓冲液（Tris-EDTA buffer）溶解DNA沉淀。

表1 日粮组成及营养水平（干物质基础）

以细菌通用引物8f[5'CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG]和1510r[5'GTG AAG CTTACG G(C/F)T ACC TTG CGA CTT]（Invitrogen公司合成）扩增每株细菌16S rRNA基因全序列（Zoetendal等，1998）。反应体系为：10×缓冲液，5 μl；dNTP（10 mmol/l），1 μl；MgCl2（25 mmol/l），4 μl；Taq DNA聚合酶（5 U/μl），0.8 μl；1 μl模板（1～10 ng/ml），上下游引物（10 μmol/l）各1 μl；加无菌双蒸水至50 μl。PCR反应条件如下：94℃，3 min预变性；94℃，45 sec；58 ℃，45 sec；68 ℃，90 sec，循环35次；68 ℃，7 min。扩增产物分别经Wizard SV Gel和PCR Clean-Up system(Promega，USA)纯化后，插入pGEM-T载体（美国，Promega）并转化入E.coli Top10，再以克隆的引物进行PCR反应以检测插入子的大小（Wright和Pimm，2003）。插入正确的阳性克隆分别用HhaⅠ、BsaⅠ等限制性内切酶进行酶切，酶切产物用4%琼脂糖凝胶电泳检测。

形态、生化试验和酶切图谱完全一样的作为一个OTU。在每个OTU中选择一个单克隆用引物SP6、T7进行测序（Invitrogen，上海）。将测序结果在GenBank中进行BLAST分析。

1.7.3 生长性能指标

分别于试验的开始和结束时对仔猪进行空腹称重，根据各组仔猪始末体重，计算平均日增重。每日观察试验仔猪生长健康状态，记录腹泻猪只头数、各栏日粮消耗量、死亡仔猪头数，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料肉比和腹泻率。

腹泻率(%)=总腹泻次数/(总头数×试验天数)×100

1.7.4 营养物质消化率

采用全收粪法在试验开始后的第21～25 d进行为期5 d的消化试验。粪样烘干后粉碎过40目筛，放置于-20℃冰箱保存备用。测定试验日粮和粪样的干物质、粗蛋白质、总能及粗灰分含量，从而计算其消化率。

1.7.5 经济效益分析

通过调查每头猪的增重收入及饲养成本，记算平均毛利。比较试验组与对照组仔猪的平均毛利，从而对经济效益进行分析。

1.8 数据处理及统计

试验数据采用SAS9.3进行t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。各组数据均以“平均值±标准误”表示。

2 结果

2.1 益生菌菌株的分离、鉴定

从断奶仔猪直肠中共分离出3个菌株，分别命名为B1、C1和S1，见表2。由表2可见，B1和C1分离自MRS培养基，为乳酸菌，C1为球菌，B1均为杆菌；S1分离自营养肉汤培养基，为芽孢杆菌。

表2 分离菌株的形态学结果

分离菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的BLAST结果见表3。结果表明：B1为德氏乳杆菌德氏亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii），C1为粪肠球菌（Enterococcus faecalis），S1为枯草芽孢杆菌分离种C9-1（Bacillus subtilis isolateC9-1）。

2.2 添加复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能的影响(见表4)

表4可见，试验组和对照组平均日采食量差异不显著（P＞0.05）；试验组与对照组相比平均末重和平均日增重差异显著（P＜0.05），添加益生菌制剂比对照组平均日增重提高了20.72%；在料肉比方面，试验组和对照组分别为1.56和1.78，添加复合益生菌制剂比基础日粮组料重比降低了12.36%，差异显著（P＜0.05）；由此可见，饲料中添加复合益生菌制剂能够提高断奶仔猪的生长性能。

表3 分离菌16S rRNA基因BLAST结果

表4 复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能的影响

2.3 添加复合益生菌制剂对断奶仔猪腹泻的影晌

表5可见，虽然试验组腹泻率和腹泻指数较对照组差异不显著(P＞0.05)，但试验组与对照组相比，腹泻率下降了22.73%，腹泻指数也有所下降，证明饲料中添加复合益生菌制剂可以在一定程度上降低断奶仔猪的腹泻率。

表5 复合益生菌制剂对断奶仔猪腹泻率的影响

2.4 添加复合益生菌制剂对仔猪营养物质消化率的影响

添加复合益生菌制剂对仔猪营养物质消化率的影响见表6，添加复合益生菌制剂的试验组与对照组相比，粗蛋白、有机物、干物质和总能消化率均有提高，其中总能、有机物分别提高了2.99%和4.15%，但差异不显著(P＞0.05)；粗蛋白和干物质分别提高5.70%和2.81%，差异显著(P＜0.05)。可见，复合益生菌制剂可在一定程度上提高仔猪对营养物质的消化能力，从而提高饲料利用率。

表6 复合益生菌制剂对仔猪营养物质消化率的影响(%)

2.5 经济效益分析

在水电、人工、管理等费用不计算在内的前提下，由表7知，对照组平均每头猪可获毛利36.42元，试验组平均每头猪可获毛利49.39元，平均每头猪试验组比对照组多获利12.97元，经济效益十分可观。

表7 复合益生菌制剂对仔猪生产经济效益分析

3 讨论

3.1 益生菌菌株的分离、鉴定

动物消化道微生物具有多样性和特异性，寄主和肠道菌之间存在着相互选择、相互依赖的关系[10]。本试验从断奶仔猪消化道分离的2株乳酸菌和1株芽孢杆菌，来源于消化道，更容易适应肠道环境，从而能更好地在仔猪体内定植发挥益生作用。

3.2 添加复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响

一般情况下，动物消化道内含有大量的有益微生物用来维持消化道的菌群平衡，但断奶仔猪肠道发育不成熟，因此，大量研究表明，添加益生菌饲喂断奶仔猪后能够提高其生长性能，提高仔猪免疫力和肠道微生物数量[6，11-13]。辛娜等[14]研究结果表明，饲喂芽孢杆菌对断奶仔猪的平均日增重及饲料转化率均没有影响。Rolfe[15]研究表明，复合菌比单一菌效果更好。本研究认为饲料中添加复合益生菌制剂能够提高断奶仔猪的生长性能，这与前人的研究结果一致。

3.3 添加复合益生菌制剂对断奶仔猪腹泻率的影响

规模化猪场的不断完善和发展，早期断奶作为提高母猪生产力的重要措施之一，但同时早期断奶仔猪肠道微生物群系受到破坏而产生应激，有益菌减少，大肠杆菌等有害菌大量繁殖，容易引起仔猪腹泻。黄金华等[16]研究表明，添加复合益生菌制剂(植物乳杆菌、嗜酸性乳杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母)能够显著降低断奶仔猪腹泻率。刘虎传等[17]研究表明，添加益生菌(植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌)饲喂断奶仔猪后能够显著降低腹泻率。本试验结果表明，添加复合益生菌制剂能够显著降低腹泻率，这与前人的结果一致。

3.4 添加复合益生菌制剂对断奶仔猪营养物质消化率的影响

益生菌在肠道内发酵，能够促进营养物质的消化吸收。黄金华等[16]研究表明，添加复合益生菌饲喂断奶仔猪后能够显著提高日粮的总能、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、灰分、钙、磷的消化率。Giang等[18]研究表明，添加乳酸菌复合菌饲喂断奶仔猪后能够提高粗蛋白、粗纤维和有机物的回肠表观消化率。本研究表明，能够显著提高粗蛋白和干物质的消化率，对有机物和总能的消化率具有提高的趋势，但差异不显著。这与前人的结果尚存在一定的差异，这可能与日粮组成、环境、猪品种等因素有关。