山东省部分地区猪源大肠杆菌毒力基因检测试验

2019-01-02李春蕾

畜牧兽医科学 2018年19期

李春蕾

（山东省烟台市动物疫病预防与控制中心，烟台 264003）

0 引言

大肠杆菌是人畜肠道内一种常见的菌株，1988年科学家发现大肠杆菌时，认为其为非致病性菌株。20世纪中期，部分学者认识到一些血清型特殊的大肠埃希菌具有致病性，特别对婴幼儿和幼畜危害巨大。致病性大肠杆菌是引起多种疾病的万恶之首，常使人畜出现严重的腹泻，如仔猪红白痢等。同时，引起仔猪水肿病、败血症以及影响畜禽生长发育等，造成畜禽的生产能力低下，严重者甚至造成大量的死亡，给养殖业带来严重的经济损失。致病性大肠埃希菌具有广泛的传播性，其通过食物、水源以及空气等经质粒结合转移等方式进行传播，进而引发疫情，给畜牧业的健康发展带来严重威胁[1]。大量研究表明，致病菌的致病机理与毒力基因有关[2]。不同来源和不同基因背景的菌株的毒力基因分布存在显著的差异[3]。研究以山东地区送检病料分离的致病性大肠杆菌为例，分析山东地区分离的致病性大肠杆菌携带毒力基因情况，探究毒力基因分布差异情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）菌株。试验菌株来源于2013—2015年从山东省不同地区养殖场采集患病猪内脏。ATCC25922药物敏感性试验标准株由实验室保存。

（2）培养基及试剂。麦康凯培养基（购自北京陆桥技术有限公司），PCRbuffer、dNTP和TaqDNA聚合酶均购于天根生化科技（北京）有限公司；DL5 000 DNA Marker购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌分离鉴定

将山东省不同地区送检病料样品于麦康凯培养基划线培养，37 ℃培养12 h，挑取单个玫红色可疑菌落，接种于非选择性MHA琼脂培养基培养，37 ℃培养12 h，挑取单菌落采用水煮法提取DNA，进行16sPCR扩增，然后测序。通过pubmed-blast比对，将鉴定为阳性的大肠杆菌保存于30%的甘油肉汤中，并置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 大肠杆菌DNA提取

将分离鉴定的大肠杆菌接种影响琼脂，37 ℃培养14 h，挑取单一菌落加入到100μL灭菌双蒸水中，100 ℃煮沸10 min，冰浴10 min，离心机12 000 rpm离心2 min，取上清，备用。

1.2.3 毒力基因检测

宋彬[4]等试验研究中设计合成的引物（见表1），由上海生物工程有限责任公司合成。

表1 大肠杆菌毒力基因的引物序列

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离鉴定

山东地区送检样品经培养基筛选，16SrRNA PCR凝胶电泳和测序鉴定见图1，最终确定共获得大肠杆菌205株。

图1 16SrRNA凝胶电泳图

2.2 大肠杆菌毒力基因检测

通过PCR检测扩增毒力基因携带情况，发现sitA携带率最高，达66.82%；其次是fimC ，携带率高达65.85%；而eaeA携带率最低为0.98%。多个毒力基因的检测表明，山东地区送检病料分离大肠杆菌携带毒力基因阳性率高，部分检测结果见图2、图3、图4。

图2 fimC毒力基因扩增结果

图3 sitA毒力基因扩增结果

图4 部分hlyF、iss、papC、iucD、irp2毒力基因扩增结果

3 讨论

大肠杆菌致病性的主要原因是产生各种毒力因子，不同大肠杆菌的致病性的产生主要与其携带的不同的毒力基因有关，研究从送检病料分离的菌株共205株，共检测发现8个毒力基因，其中各种毒力基因的携带情况各不统一，其中携带毒力基因最多的为sitA和fimC，而其中fimC是高致病力菌株的标致基因，大量毒力基因携带和传播是致病性大肠杆菌防控的主要难点[5]。有不同的研究人员通过探究大肠杆菌的毒力基因以及血清型分析大肠杆菌的致病性，不少专家认为质粒具有传递性，当致病性大肠杆菌的质粒上携带大量毒力基因时，增加了传递的风险和危害，同时给养殖业造成了巨大的经济风险[6]。大量不同的研究方法发现，细菌携带大量毒力基因影响畜牧业的健康发展[7]。