巴马汀对大鼠BMSC成骨成脂分化相关标志物的表达调控研究

彭京平，庞荣清，张 利

巴马汀（PM）是从黄连中提取的多种活性生物碱之一，具有抗病原微生物、调节血压、抗炎、增强机体免疫等多种药理作用[1]。Ishikawa等[2]和Chen等[3]报道，该药还具有抑制破骨细胞增殖和抑制骨吸收的作用，提示PM可能是潜在的抗骨质疏松治疗药物。然而，上述研究未能充分明确PM抗骨质疏松的分子机理，尤其是在调节骨髓间质干细胞（BMSC）分化及促成骨方面的作用尚无报道。本研究探索了PM对BMSC成骨成脂分化相关标志物的表达的调控作用，期望为进一步全面阐明PM抗骨质疏松的药理作用及相关药物新功能开发提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 盐酸巴马汀（PM，≥95%，大连美仑）；PCR 试剂盒（TAKARA）；DMEM（Hyclone）；CCK-8试剂盒（日本同仁）；TRIZOL（Hyclone）；FBS（Gibco）；BSA（Biosharp）；DMSO（Sigma）；大鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒（Solarbio）；抗 Runx2、ALP、COL1、OCN、PPARγ 和 Lpl抗体及二抗（Abcam）。

1.2 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，2～3周龄（昆明医科大学，许可证：SCXK-滇 2005-0008）。

1.3 研究方法

1.3.1 BMSC原代培养和诱导分化 BMSC分离、纯化与鉴定：处死SD大鼠，无菌条件下取双侧胫、股骨，75%酒精浸泡20 min，PBS冲洗3次，去骨骺，以5 ml L-DMEM培养液冲出骨髓，收集细胞悬液，按1∶1 加入大鼠淋巴细胞分离液（Ficoll，密度 1.083），2500 g、4℃、梯度离心20 min；吸取中间薄膜层细胞，加入新配 L-DMEM 调整细胞密度（1×108/ml），接种于培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。流式细胞仪分析BMSC表面标记抗原，以CD29及CD44表达阳性、且CD14、CD34和CD45表达阴性细胞为BMSC。

BMSC诱导分化培养：取培养第3代的BMSC细胞诱导分化，培养液为含有10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠及50 mg/L维生素C的培养液。

1.3.2 药物母液制备 称取PM标准品1178.25 μg，加入甲醇100 μl溶解，再加入DMEM溶液至10 ml，混合、摇匀，即得到母液。

1.3.3 CCK-8实验确定PM的给药浓度 取诱导分化培养的BMSC制备细胞悬液（细胞密度4.0×104/ml），种入96孔板（置复孔6个），常规培养24 h后，分别加入含不同浓度 PM（5、10、20、40、80、160、320 μmol/L）培养基，继续培养 48 h；每孔加入 10 μl CCK-8试剂工作液，继续培养2 h后，在450 nm波长下测定各孔吸光度，根据检测结果确定后续实验的PM浓度。

1.3.4 Real-time PCR法检测成骨及成脂相关基因表达 取诱导分化完毕的BMSC制备细胞悬液（细胞密度1.5×105/ml），种入6孔板，随机分为空白组、PM低浓度组、PM高浓度组，空白处理组以0.2%BSA溶液培养细胞；PM低、高浓度组分别以含有PM 40 μmol/L 或 80 μmol/L 的 0.2%BSA 溶液培养细胞。各组继续培养2 d后，1000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀；以Trizol提取细胞总RNA，采用TAKARA反转录酶试剂盒逆转录为cDNA；以20 μl体系放入DNA扩增仪中扩增，检测成骨相关基因Runx2、ALP、COL1、OCN 及成脂相关基因 PPARγ、Lpl的mRNA表达水平。以GAPDH为内参基因，各目的基因与GAPDH的起始拷贝数比值表示各目的基因的相对表达量，实验重复3次。相关内参及目的基因引物见表1。

1.3.5 Western法检测成骨及成脂相关蛋白表达诱导培养的BMSC按1.3.4进行分组并经PM处理后，用蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，并以BCA法定量蛋白。随后取50 μg已定量的蛋白样品上样分析，100 V恒压转移2 h后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将NC膜与一抗室温孵育1 h；经TBST缓冲液洗膜3次（10 min/次）后，加入二抗室温孵育1 h，再以同样方法洗膜3次。使用化学发光法显影检测目的蛋白表达量或磷酸化水平。实验重复3次。

表1 相关基因PCR引物序列

2 结果

2.1 CCK实验结果 根据CCK实验结果，PM高浓度综合选取位于峰值附近浓度以便于配置，即80 μmol/L，PM 低浓度组则减半选取 40 μmol/L。

2.2 PM对BMSC成骨相关标志物基因表达的影响 低浓度和高浓度的PM均可显著上调成骨相关标志物Runx2、ALP、COL1和OCN的mRNA表达水平。其中低浓度PM对Runx2、ALP、COL1和OCN的mRNA表达上调幅度分别为91.3%、77.8%、41.2%和22.4%（P＜0.05），而高浓度PM上调幅度分别为 226%、206%、73.4%和 34.5%（P＜0.05）。 见图1。

与对各基因表达调控结果类似，低浓度和高浓度的PM同样可剂量依赖性上调Runx2、ALP、COL1和OCN蛋白表达。其中低浓度PM对Runx2、ALP、COL1和OCN的蛋白表达上调幅度分别为125%、93.9%、34.1%和 28.7%（P＜0.05），而高浓度 PM 表达上调幅度分别为291%、227%、61.6%和43.3%（P＜0.05）。 见图 2。

2.3 PM对BMSC成脂相关标志物基因表达的影响 与对成骨相关标志物表达基因调控结果相反，PM低浓度和高浓度均可显著抑制成脂相关标志物PPARγ和Lpl的mRNA表达水平。其中低浓度PM对PPARγ和Lpl的mRNA表达抑制程度分别为25.9%和26.9%（P＜0.05），而高浓度PM对PPARγ和 Lpl的抑制程度分别为 52.8%和 43.8%（P＜0.05）。 见图 3。

同样，PM低浓度和高浓度均可显著抑制成脂相关基因PPARγ和Lpl的蛋白表达水平。其中低浓度PM对PPARγ和Lpl的蛋白表达抑制程度分别为30.5%和30.9%（P＜0.05）；而高浓度PM抑制程度分别为53.2%和43.2%（P＜0.05）。见图4。

图1 PM对诱导分化的BMSC中成骨相关标志物Runx2、ALP、COL1和OCN mRNA表达的影响

图2 PM对诱导分化的BMSC中成骨相关标志物Runx2、ALP、COL1和OCN蛋白表达的影响

3 讨论

目前临床上治疗骨质疏松的药物根据其机理主要有两大类[4]，分别是骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。骨吸收抑制剂包括钙制剂、双膦酸盐类、雌激素及选择性雌激素受体调节剂、维生素D及活性代谢物、降钙素等，是目前治疗骨质疏松的主要药物。然而此类药物主要通过抑制破骨细胞的骨吸收作用，延缓骨量丢失，对于已经丢失的骨组织无作用，不能有效地增加骨密度、改善骨结构、降低骨折发生的风险。骨形成促进剂主要为甲状旁腺激素，人重组甲状旁腺激素rhPTH(1-34)（Forteo）是现今唯一已上市的骨形成促进剂，但由于其具有增加高钙血症和骨肉瘤的危险，因此，大大限制了该药的临床使用[5]。因此，探索和开发新型骨形成促进剂是当前的研究热点。

传统中药在治疗骨质疏松、尤其是在调节骨代谢平衡方面具有一定的优势。中医传统理论认为，骨质疏松症应归属“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”等范畴，病因在于肾精不足、骨失滋养，进而导致的全身骨骼的慢性退行性改变。根据2015年中医药防治原发性骨质疏松症专家共识，六味地黄汤加黄柏是阴虚火旺证明显的骨质疏松患者的推荐方剂之一[6]。而PM、小檗碱等均是黄柏的主要成分，提示小檗碱类衍生物对相关证候所致骨质疏松具有潜在预防和治疗价值。此外，国外前期基础研究也表明，黄连、黄柏等中药中所含的小檗碱类衍生物，如PM、小檗碱、黄连碱等，均有着较好的抑制破骨细胞增殖和减缓骨吸收的作用[2,7]。根据以上中医药理论和前期的实验工作基础上，本研究首次发现，PM对BMSC具有明显的促成骨、抑成脂的双向调控功能，表明PM很可能是一种新的潜在的骨形成促进剂。值得关注的是，在本研究所涉及的成骨相关标志物中，Runx2和ALP属于骨形成早期的相关标志基因，而COL1和OCN则属于骨形成晚期标志基因[8]。本研究结果显示，虽然PM对上述基因表达均具有显著的促进作用，但PM对成骨早期标志物表达的促进作用（高浓度PM对Runx2和ALP mRNA和蛋白表达水平上调均超过对照3倍以上，见图1A和B）却显著强于对晚期标志物表达的促进作用（高浓度PM对COL1和OCN mRNA和蛋白表达水平上调均不足对照1倍，见图1C和D），提示PM促进BMSC向成骨分化的作用可能主要在早期成骨分化阶段，更确切的调控机制仍有待进一步研究确证。

图3 PM对诱导分化的BMSC中成脂相关标志物PPARγ和Lpl mRNA表达的影响

图4 PM对诱导分化的BMSC中成脂相关标志物PPARγ和Lpl蛋白表达的影响