不同时期肢体缺血对缺血再灌注心肌PPARβ/δ表达的影响
2019-01-02任冰稳张宝和连士杰
任冰稳,张宝和,连士杰,陈 洪,张 洋
心肌保护一直是心血管领域病变冠脉再通造成心肌缺血再灌注损伤的重要研究方向。远隔缺血预处理(RIpreC)是指一个器官或组织的短暂缺血再灌注可对远隔器官随后发生的缺血产生保护作用。最早由Przyklent等于1993年提出,并在随后的研究中得到证实。外周肢体骨骼肌的缺血处理由于简便易行,是目前研究的热点,并有研究将肢体缺血处理放在心肌缺血再灌注的不同时期进行[1-3],但干预时机尚存在争议。
过氧化物酶体增殖物激活受体 β/δ(PPARβ/δ)在心肌组织中表达丰富,属于甾体类核受体超家族的成员,既往研究表明,其调控靶基因参与心肌细胞能量、凋亡、炎症等多种病理生理过程[4-6]。本研究以双下肢缺血作为远隔缺血处理方法,在心肌缺血和再灌注不同时期间断多次给予心肌缺血再灌注大鼠双下肢非致死性缺血处理,检测各组血清中心肌损伤 标志物 CK-MB、cTnI含 量 和心 肌 PPARβ/δ mRNA和蛋白表达的变化,为心肌缺血再灌注损伤的防护提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 大鼠CK-MB、cTnI ELISA检测试剂盒(美国Rapidbio公司);RT-PCR检测试剂盒(日本TaKaRa公司);DNA marker(北京天根生化科技公司); 羊抗鼠 PPARβ/δ一抗(美国 Santa Cruz公司);兔抗羊辣根过氧化物酶标记二抗(美国Santa Cruz公司)。
1.2 实验动物及分组 健康雄性Wister大鼠40只(北京维通利华公司,合格证号:SCXK2012-0001),体质量280~300 g,普通饲料喂养,自由饮水。饲养1 w后随机分成4组,分别为单一心肌缺血再灌注对照组(MI-R组)、心肌缺血期远隔处理组(RLIPerC组)、心肌缺血前远隔处理组(RLIPreC组)、心肌缺血再灌注期远隔处理组(RLIPostC组),每组10只。每组均行冠状动脉前降支结扎30 min后再灌注2 h,并解剖出双侧股动脉。RLIPerC组、RLIPreC组、RLIPostC组以无损伤血管钳夹闭双侧股动脉5 min开放5 min,共3个循环,但处理时间不同。RIPerC组与冠状动脉前降支结扎同时进行,RIPreC组在冠状动脉前降支结扎前30 min进行,RIPostC组在冠状动脉前降支结扎结束后再灌注时进行。
1.3 缺血再灌注大鼠模型制备 参考文献[6]方法,大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后,四肢连接心电图机,监测Ⅱ导联心电图。气管插管后连接动物呼吸机,参数设定通气频率70次/min,吸呼比1.25/1。开胸暴露心脏后,带6-0线的眼科针在冠状动脉根部下2 mm、肺动脉窦和左心耳之间穿过,线结内垫一塑料管,收紧线结观察到心肌组织颜色变暗,心电记录ST段抬高。约30 min后,松开结扎线、拔出塑料管,再灌注(恢复冠状动脉血供)2 h(成功标志:局部组织充血,抬高的ST段相对降低>1/2或高耸的T波下降)。再灌注结束后,留取血液标本,迅速剪下心脏,在左心室前壁心梗相同位置留取心肌组织液氮冷冻,用以提取蛋白和RNA。
1.4 血清CK-MB和cTnI含量测定 实验结束后,经腹主动脉穿刺取血液标本,离心分离血清后-80℃封存。按照试剂盒说明书检测血清CK-MB和cTnI含量。
1.5 心肌PPARβ/δ mRNA含量测定 参考文献[7]方法,用RT-PCR试剂盒检测各组心肌组织PPARβ/δ mRNA含量。PPARβ/δ上游序列5'-AGC ACA TCT ACA ATG CCT ACC T-3',下游序列 5'-TCT TGG CGA ACT CGG TGA-3',产物大小为 258 bp;内参照物GAPDH上游序列5'-CCA AGA AGG CTG GGG-3',下游序列5'-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3',产物为196 bp。
1.6 Western blot法检测心肌PPARβ/δ蛋白含量测定 称取心肌组织100 mg,制作蛋白样品,测定蛋白浓度,计算各样品上样量。采用BIO-RAD电泳系统以60 V电压进行SDS-PAGE垂直电泳,40 V的电压转膜3 h,含5%脱脂奶粉TBST封闭1.5 h,置于羊抗鼠PPARβ/δ一抗中4℃过夜,TBST洗膜后加入兔抗羊二抗,室温下孵育2 h。TBST洗膜后加入发光液进行曝光。将PPARβ/δ与GAPDH条带的灰度值与面积的乘积之比,作为PPARβ/δ蛋白的相对含量。
1.7 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件分析,计量资料以±s表示,组间比较采用方差分析和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组血清CK-MB、cTnI含量比较 再灌注2 h后,与MI-R组相比,另外3组CK-MB和cTnI水平比较均显著降低(P<0.05),且3组间无明显差异(P>0.05)。 见表 1。
表1 各组血清CK-MB和cTnl含量比较(n=10)
2.2 各组心肌PPARβ/δ mRNA含量比较 再灌注2 h后,与MI-R组相比,另外3组心肌PPARβ/δ mRNA表达水平显著升高(P<0.05),且3组间含量比较无明显差异(P>0.05)。见图和表2。
表2 各组心肌PPARβ/δ mRNA和蛋白含量比较(n=10)
2.3 各组PPARβ/δ蛋白含量比较 再灌注2 h后,与MI-R组相比,另外3组心肌PPARβ/δ mRNA表达水平显著升高(P<0.05),且3组间比较无明显差异(P>0.05)。见图2和表2。
图1 RT-PCR检测各组大鼠心肌PPARβ/δ的mRNA表达
图2 Western blot检测各组大鼠心肌PPARβ/δ蛋白表达
3 讨论
尽可能减轻血管再通后心肌缺血再灌注损伤一直是人们努力的目标。Gao等[8]对包括540例患者的9个临床试验的meta分析表明,ST段抬高的心肌梗死患者PCI术冠脉开通前后不同时期给予肢体缺血再灌注处理,均可使术后72 h内的CK-MB峰值和曲线下面积下降,ST段回落改善。但并不是所有的研究均表明,远端肢体缺血处理可有效减轻缺血心肌血管再通导致的再次心肌损伤,并且在心肌缺血再灌注不同时期给予肢体缺血处理,对心肌损伤的影响是否存在差异尚需进一步探讨。本研究在大鼠心肌缺血前、心肌缺血时和心肌缺血再灌注后3个不同时期给予双下肢股动脉5 min夹闭5 min再灌注共3个循环的缺血处理,发现与对照组相比,均可降低心肌损伤标志物CK-MB和cTnI水平。
PPARβ/δ在心脏表达量比较高,环前列腺素、某些脂肪酸、视黄酸是PPARβ/δ的天然激动剂,GW50151、GW0742、LBX001、L-165041 是人工合成的PPARβ/δ强激动剂,但均尚未应用于临床。既往研究表明,心肌IR损伤的机制涉及多个方面,与心肌能量代谢、氧化应激、炎症、凋亡、电生理等多种因素有关[9-10]。而PPARβ/δ可通过多个途径发挥心肌保护作用:(1)促进心肌细胞再生:心肌再生能力很低,Park等[11]研究表明,专一性过表达 PPARβ/δ的心肌细胞增生能力增强,心脏专一性过表达PPARβ/δ 小鼠心梗面积减小,心功能改善。PPARβ/δ激动剂也有相同的作用。(2)抑制心肌细胞凋亡:研究表明,PPARβ/δ激动剂GW501516可减少脂多糖诱导的心肌细胞凋亡,并呈剂量依赖关系,与增加bcl 2/bax比值、抑制核因子NF κB的转运有关[12]。(3)改善心肌重构:Chang等[13]的研究发现,替米沙坦通过增加PPARβ/δ表达,改善糖尿病大鼠心肌细胞纤维化。(4)改善心肌能量代谢:PPARβ/δ可通过调节心肌细胞葡萄糖和脂肪酸的利用,改善心功能,减轻心肌肥厚、心力衰竭、心肌炎症反应[14]。(5)降低局部炎症反应:PPARβ/δ激动剂GW501516在体内外可通过抑制NF-κB活化,降低炎症因子TNF、MCP-1、IL-6 表达[15]。 本研究发现,与单一心肌缺 血 再 灌 注 大 鼠 相 比 较 ,RLIPerC、RLIPreC、RLIPostC组大鼠心肌PPARβ/δ mRNA和蛋白表达均显著升高,提示不同时期远隔肢体缺血处理诱导心肌PPARβ/δmRNA和蛋白表达增加,可能通过上述多种途径对再灌注心肌发挥保护作用。
总之,无论是在心肌缺血前、心肌缺血同时,还是在心肌缺血再灌注后给予远隔肢体缺血处理,均可减轻心肌损伤,且无明显差异。心肌PPARβ/δ mRNA和蛋白表达升高可能与远隔肢体缺血处理的心肌保护有关,未来PPARβ/δ激动剂可考虑应用于冠心病PCI患者,以减轻心肌缺血再灌注损伤。