凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁的工艺优化及主要成分变化

马若霜，方海田*，刘慧燕，王 茹，刘予煊，李金娜，赵贝贝，周 婷，胡晓磊

（1.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

枸杞（Lycium barbarumL.）为茄科多年生落叶灌木，又名贡果、血杞子、枸杞豆，其不含任何毒素，可以长期食用，是卫生部公布的可以药食同源的中药之一[1]。枸杞的营养成分丰富，富含蛋白质、脂肪、多糖、胡萝卜素，维生素B1、维生素B2、多种氨基酸，具有补肾益精、养肝明目、润肺止咳等功效，有降低胆固醇、减轻动脉硬化、降低血糖等作用[2-4]。对枸杞的应用也有诸多报道，如成堃等[5]以蓝莓、枸杞、全脂奶粉为原料，研究了蓝莓枸杞风味酸奶的发酵工艺；郭红莲等[6]通过对天然枸杞酵素发酵的代谢产物进行分析，鉴定出64种风味物质，并具有较强的自由基清除能力、还原力，总酚含量达到1.926 mg/mL；刘喜林等[7]利用植物乳杆菌对百合枸杞发酵液进行了研究；刘亚等[8]以枸杞鲜果为原料接种酵母菌发酵枸杞酒，测定分析了代谢产物中含量较多的醇类、酯类、羧酸类、醛酮类物质以及枸杞酒发酵前后类胡萝卜素的含量变化。

但是，利用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）对枸杞汁发酵的研究还未见报道。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值[9-11]，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌（Bifidobacterium）等有益菌的生长和繁殖。凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比有利于恢复胃肠道的微生态平衡[12-13]，菌体在通过肠前消化道时可保持较高的存活率，是一种有重要价值的益生菌，被卫计委批准列入新食品原料目录[14]。

本试验以宁夏枸杞干果为主要材料，进行凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁工艺条件优化并分析发酵期间枸杞汁中总糖、总黄酮、蛋白质、乳酸等主要成分的变化，旨在研制出一种能够调节肠道功能的凝结芽孢杆菌枸杞汁，进而提高发酵枸杞汁的营养与风味，为凝结芽孢杆菌在发酵枸杞汁方面的应用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞：中宁枸杞；凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）：中国工业微生物菌种保藏管理中心（chinacenterofindustrial culture collection，CICC），菌株编号CICC21735。

营养肉汤（nutrient broth，NB）、营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；白砂糖、小苏打：市售；D-异抗坏血酸钠（食品级）：江西省德兴市百勤异VC钠有限公司；芦丁标准品（纯度≥98%）、牛血清白蛋白（纯度≥98%）、考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；HSU-10手持糖量计：上海精密仪器仪表有限公司；V-5100紫外可见分光光度计：上海精科实业有限公司；PB-IO型精密PH计：赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 枸杞汁制备及菌种活化

挑选完整无霉变的干枸杞，称质量，清洗后沥水，将浸泡的枸杞放入搅拌机中打浆，反复搅打3次使其细腻，加入混合液体积0.4%D-异抗坏血酸钠护色，用小苏打调节pH至6.5～7.0，巴氏灭菌。将凝结芽孢杆菌接种到灭菌的营养琼脂培养基中，在恒温箱中培养（发酵温度30℃），连续传代2～3次，使活力最终达到最佳，在三角瓶中进行扩大培养制备生产发酵剂。

1.3.2 发酵方式的确定

将枸杞汁加入5%的白砂糖，放入65℃的水浴锅中杀菌30 min，按照接种量6%，发酵温度30℃，进行发酵，考察静置发酵（0 r/min）和微氧发酵（50 r/min）时枸杞汁的乳酸含量与感官评分。

1.3.3 单因素试验设计

将枸杞汁加入5%的白砂糖，放入65℃的水浴锅中杀菌30 min，按照接种量6%，转速50 r/min，发酵温度30℃进行发酵，每2 h测定其乳酸含量与感官评分。

固定发酵时间10 h，发酵温度30℃，考察不同接种量（4%、6%、8%、10%、12%）时枸杞汁的乳酸含量与感官评分。

固定接种量6%，发酵时间10 h，发酵温度30℃，考察不同白砂糖的添加量（3%、4%、5%、6%、7%）时枸杞汁的乳酸含量与感官评分。

固定接种量6%，发酵时间10 h，白砂糖添加量5%，转速为0，考察不同发酵温度（30℃、33℃、36℃、39℃、42℃）时枸杞汁的乳酸含量与感官评分。

固定接种量6%，发酵时间10 h，发酵发酵温度30℃，考察不同转速（25 r/min、50 r/min、75 r/min、100 r/min）时枸杞汁的乳酸含量与感官评分。

1.3.4 响应面法优化凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁工艺试验

在单因素试验的基础上，进行响应面Box-Benhnken试验设计，选择接种量、白砂糖添加量、发酵温度、转速这4个因素，建立4因素3水平的响应面试验，以乳酸含量与感官评分为响应值进行优化。两个响应值所占权重各为50%，响应面试验因素与水平如表1。

表1 枸杞汁发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for goji juice fermentation conditions optimization

1.3.5 测定方法

乳酸含量的测定：使用SBA-40E生物传感分析仪测定。

感官评定：为评价不同发酵方式对制备的凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁感官评分的影响，由经过培训的10人组成评分小组，从色泽、体态、香气、口感4个方面对各枸杞汁样品进行评分。评分细则如表2所示。

表2 发酵枸杞汁感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of fermented goji juice

总糖的测定：采用苯酚-浓硫酸比色法[15]；总黄酮的测定：以芦丁为标准品，采用分光光度法[16]；蛋白质的测定：采用考马斯亮蓝G-250法[17]；活菌数的测定：按照倾注平板法计数[18]；大肠菌群的测定：按照GB4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的方法进行检测[19]。

2 结果与分析

2.1 枸杞汁发酵方式的确定

由图1可知，当静置发酵（转速为0）时，乳酸菌生长和繁殖速度较慢；当微氧发酵（转速为50 r/min）时，产生乳酸含量较高。而感官评分在微氧条件下明显更高，凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，说明微氧的环境下能够促进凝结芽孢杆菌生长繁殖，进行发酵产酸。综合考虑选择微氧条件进行发酵。

图1 发酵方式对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响Fig.1 Effect of fermentation mode on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2 枸杞汁发酵条件的单因素试验结果

2.2.1 枸杞汁发酵时间的确定

由图2可知，前2 h内乳酸含量和感官评分变化比较缓慢，为凝结芽孢杆菌的繁殖和适应期，在2～8 h期间内，凝结芽孢杆菌利用发酵液中丰富的糖进行乳酸发酵，产生大量乳酸，感官评分上升。8～10 h内指标变化平缓，为发酵后期，凝结芽孢杆菌已将大部分糖转化成乳酸。因此确定发酵结束周期为10 h。

图2 发酵时间对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation time on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.2 接种量对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

如图3所示，当接种量为4%～8%时，乳酸含量随接种量的增加呈明显上升的趋势（P＜0.05）；当接种量＞8%之后，乳酸含量增长变小。感官评分随着接种量的增大呈现逐渐减少的趋势。当接种量为8%时，乳酸含量为151mg/100mL，感官评分为78分。考虑节约成本、简便操作等因素，选择接种量为8%为最适接种量。

图3 接种量对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.3 白砂糖添加量对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

如图4所示，随着白砂糖添加量的升高，乳酸含量及感官评分均随之升高；当白砂糖添加量≥5%之后，发酵液的乳酸含量增长变小，且感官评分开始降低。白砂糖添加量为5%时，乳酸含量为155 mg/100 mL，感官评分为91.2分。因此选取5%为最适白砂糖添加量。

图4 白砂糖添加量对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响Fig.4 Effect of sugar addition on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.4 发酵温度对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

如图5所示，当发酵温度较低时，乳酸菌生长和繁殖速度较慢，活菌数随着温度的升高而显著增加（P＜0.05）；当发酵温度高于36℃之后，乳酸含量呈逐渐下降的趋势；发酵温度在33～39℃时，感官评分差异不显著（P＞0.05），而当温度过高或过低时，枸杞发酵液的感官评分均较低。当发酵温度为36℃时，枸杞汁乳酸含量为160 mg/100 mL，感官评分为88分。综合考虑选择36℃为最佳发酵温度。

图5 发酵温度对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.5 转速对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

如图6所示，当转速为25～50r/min时，乳酸菌生长和繁殖速度较慢，乳酸含量随着转速的升高而增加（P＜0.05）。当转速＞50 r/min之后，乳酸含量降低。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，说明微氧的环境下能够促进凝结芽孢杆菌生长繁殖，进行发酵产酸。在转速为50～100r/min时，感官评分明显降低（P＜0.05）。当转速为50r/min时，枸杞发酵液的乳酸含量为158mg/100mL，感官评分为89分。综合考虑选择50r/min为最佳转速。

图6 转速对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响Fig.6 Effect of rotation speed on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.3 响应面法优化凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁工艺试验结果

2.3.1 优化结果和方差分析

根据单因素试验结果，由Design-Expert10.0.7统计分析软件设计出的试验方案如表3所示，两个响应值所占权重各为50%，得到综合评价（Y）对自变量接种量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵温度（C）、转速（D）为的回归方程分别为：

Y=125.70+1.54A-0.42B+1.04C+1.58D+3.00AB+1.38AC+1.25AD-5.50BC+1.25BD+3.75CD-5.52A2-5.16B2-10.73C2-4.41D2

表3 枸杞汁发酵条件优化响应面试验结果与分析Table 3 Results and analysis of response surface experiments for goji juice fermentation conditions optimization

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型中P值＜0.01，说明本试验所选用的二次多项模型差异极显著。失拟项不显著（P＞0.05）。模型决定系数R=0.993 1，说明乳酸含量和感官评分的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，所以该模型拟合效果较好，可以用此模型分析和预测凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁的发酵工艺。模型中接种量（A）、发酵温度（C）、转速（D）、接种量和白砂糖添加量交互项（AB）、接种量和发酵温度交互项（AC）、接种量和转速交互项（AD）、白砂糖添加量和发酵温度交互项（BC）、白砂糖和转速交互项（BD）、发酵温度和转速交互项（CD）、接种量二次项（A2）、白砂糖添加量二次项（B2）、发酵温度二次项（C2）、转速二次项（D2）对响应值影响显著。

2.3.2 因素间交互作用分析

响应面法是优化存在多因素影响试验条件的寻优方法，通过固定数量的试验次数连续的对试验因素进行分析，并得到直观的3D曲面图进而评价各因素之间的交互作用。根据软件Design-Expert10.0.7获得响应值的3D曲面，分析各因素对乳酸含量的影响及各因素间的交互作用。根据等高线的形状可以明显地反映出试验因素之间交互作用显著性的强弱，例如接种量、白砂糖添加量、发酵时间、转速及其交互作用对响应值的影响。当等高线的形状为椭圆形或马鞍形时，说明其交互作用显著；当等高线的形状为圆形时，说明其交互作用不显著[20]。

由图7可知，在交互作用对枸杞汁综合评分影响中，接种量和白砂糖添加量、接种量和发酵温度、接种量和转速、白砂糖和发酵温度、白砂糖添加量和转速、发酵温度和转速交互项均产生了显著影响。

图7 不同因素交互作用对发酵枸杞汁综合评分的影响Fig.7 Comprehensive score of different factors on lactic acid content of fermented goji juice

2.3.3 模型验证试验结果

对回归方程求解，即乳酸含量达到最大值时的发酵条件为接种量8.34%，白砂糖添加量4.98%，发酵温度36.32℃，转速56.16r/min，最大乳酸含量达到161.66mg/100mL，感官评分为90.51分。为方便实际操作将试验条件定为接种量8%，白砂糖添加量5%，发酵温度36℃，转速50 r/min，取三等分枸杞汁进行平行验证试验，验证试验所得平均乳酸含量为162 mg/100 mL，感官评分为91分。结果表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值比较吻合，证明用响应面法可以有效的优化凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁的工艺。

2.4 最佳发酵条件下枸杞汁主要成分的变化

对上述发酵枸杞汁进行理化指标测定，结果表明，发酵10 h后的枸杞活菌数为2.1×108CFU/mL；总糖下降至95.6 μg/mL，蛋白质含量下降至0.2 μg/mL，总黄酮含量为0.309 mg/mL，未发生变化。

3 结论

采用响应面法对凝结芽孢杆菌发酵枸杞汁的条件进行优化，建立了乳酸含量和感官评分的回归模型，由该模型优化的发酵条件为接种量8%、白砂糖添加量5%、发酵温度36℃、转速50 r/min、发酵10 h，在此最优条件下，可以得到颜色为鲜红色、口感柔和、酸甜适中、并具有典型枸杞香味的枸杞发酵饮品。其pH值为4.40，可溶性固形物含量为10.2%，总糖含量为95.6μg/mL，乳酸含量为162mg/100mL，蛋白质含量为0.2 μg/mL，总黄酮含量为0.309 mg/mL，感官评分91分。