全因子试验设计优化产ACE抑制肽羊乳发酵工艺及其冷藏研究

陈 合，李仪琳*，张博文，王 媛

（陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021）

高血压已成为当今危害人类健康的高发病症，在我国高血压患病率仍保持增长趋势[1]，且近几年的高血压患病人群趋于低龄化。目前，传统的降压药虽具有抗高血压作用，但同时也具有一些副作用[2]。因此，人们逐渐趋向于选择安全性高，可靠的生物抑制肽[3]，而血管紧张素转换酶（angiotensinconveningenzyme，ACE）抑制肽则是一个成功的商业化应用案例[4]。ACE是一种与膜结合的含Zn2+和Cl-的羧肽酶，主要存在于哺乳动物的血浆及组织中。在肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）中，血管紧张素原在肾素的作用下形成无活性的血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ在ACE的转化作用下形成可促进血管收缩并导致血压升高的血管紧张素Ⅱ；在激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）中，激肽原在激肽释放酶的作用下形成可使血管舒张的舒缓激肽，舒缓激肽可促进血管舒张，进而使得血压降低。而ACE可使舒缓激肽失活，从而抑制其降压作用[5-8]。因此，ACE活性的抑制可有效避免高血压的发生。而ACE抑制肽（降压肽）能有效抑制ACE活性，进而抑制RAS中的血压升高效应和促进KKS中的血压降低效应，最终起到降低高血压的作用[9-10]。并且ACE抑制肽和其他降压药物相比，具有安全性高、无副作用、分子质量低、实用等优点[11]。

ACE抑制肽的制备方法有直接提取、化学合成、微生物发酵和酶解法。产生ACE抑制肽的主要方法是乳制品的微生物发酵。近年来，已发现多种益生菌用于发酵ACE抑制肽。GOBBETTI M等[12]使用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）SS1和乳脂乳杆菌（L.lactissubsp.cremoris）FT4混合制备ACE抑制肽；NIELSEN M S等[13-14]研究发现，两株瑞士乳杆菌（L.helveticus）的发酵产物具有很强的ACE抑制活性，当pH值从4.6降至4.3时，ACE抑制活性增加，并且冷藏可以显著增加ACE抑制活性。

课题组在前期筛选出一株在发酵羊乳中产ACE抑制肽能力强的保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）LB6基础上[15]，本研究以山羊乳为原料，产ACE抑制肽菌株保加利亚乳杆菌LB6和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）ST为发酵菌株，采用全因子试验设计对其在发酵羊乳中产ACE抑制肽的发酵工艺条件进行优化，并研究冷藏对发酵羊乳理化性质及质构的影响，以提高发酵羊乳中ACE抑制肽的含量，为后续开发含降压肽的酸羊乳提供技术支持和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）LB6、嗜热乳链球菌（S.thermophilus）ST：陕西科技大学食品与生物工程学院。

1.1.2 试剂

全脂羊奶粉：陕西红星乳业有限公司；酵母浸粉：北京奥博星生物技术公司；血管紧张素转换酶（ACE）（0.1U/mL）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）：美国Sigma公司。

1.1.3 培养基

MRS培养基、M17培养基：青岛希望生物科技有限公司；复水后的肉汤121℃灭菌15 min，冷却后用于培养益生菌。

1.2 仪器与设备

YX-280D型手提式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备厂；DH5000AB型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型酸度计：上海精科仪器有限公司；MDF-382E型超低温冰箱：日本SANYO公司；TA.XT型物性测试仪：英国Stable Micro System公司；UV-5300PC型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Q2-901型旋涡混合仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TG16A-WS型台式高速离心机：湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；FD-1D-50型真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化

将保加利亚乳杆菌LB6的冻干菌粉接种至MRS培养基中，嗜热乳链球菌ST的冻干菌粉接种至M17培养基中[16]，于37℃条件下24h培养活化3代，使种子液中菌体浓度均为1×1011CFU/mL，备用。

1.3.2 发酵乳的制备

在无菌操作条件下，按5%（V/V）的接种量将活化后的保加利亚乳杆菌LB6和嗜热链乳球菌ST接种至固形物含量为14%的无菌复原全脂羊乳中，37℃培养12 h至凝乳，并保存于冰箱4℃备用。

1.3.3 全因子试验设计

表1 羊乳发酵条件优化全因子试验因素与水平Table 1 Factors and levels of full factorial experiments for optimization of goat milk fermentation conditions

1.3.4 冷藏对发酵羊乳理化性质及质构的影响

采用最优发酵工艺参数制备发酵羊乳，同批次制作样品6份，于4℃冷藏，分别于0d（即发酵结束时）、3d、7d、14d、21 d和28 d时随机取样，测定其pH值、酸度、活菌数、ACE抑制率和质构的变化情况，并对其进行感官评价，重复3次测量。

1.3.5 测定方法

ACE抑制率的测定：采用文献[12-13]的方法测定。

活菌数的测定：取已活化的益生菌ST和LB6按5%（V/V）的接种量接种至浓度为14%的复原全脂羊乳中，于37℃发酵培养24 h，每隔2 h取样测定OD600nm值。

酸度的测定：采用氢氧化钠滴定法[17]，以吉尔涅尔度（°T）表示。

pH值的测定：采用pHs-3c酸度计在室温条件下直接测定。

感官评价：由5位及以上感官正常人员经培训后品尝，描述产品的表层外观、组织状态、口感、滋气味、乳清析出等感官性状。评分标准见文献[18]，满分为10分。

断路器垂直连杆与连杆轴套密封件之间存在机械磨损，是造成断路器合闸时间、合闸不同期时间严重超标和合闸速度偏低的直接原因。而造成断路器垂直连杆与轴套密封件磨损的根本原因可能存在以下3个方面：

质构分析[19-21]：试验选用TA.XT型物性测试仪进行测定，A/BE探头的压力盘直径为40 mm。测定参数：测前运行速度与测试速度为1.0 mm/s、测后速度为10.0 mm/s；测试深度30.0 mm；感应力：Auto-1.0 g；记录速率：400 pps。每种样品重复测定3次。测定的指标有：硬度、稠度、凝聚性和黏度。

1.3.6 统计分析

羊乳生产条件的优化采用JMP10Pro（SASJMPStatistical10）软件进行全因子试验分析，影响因子的确定采用方差分析法。

2 结果与分析

2.1 混菌发酵羊乳生产条件优化的全因子试验

对菌株LB6和ST混合发酵生产发酵羊乳的条件进行优化，发酵羊乳的ACE抑制率、活菌数及感官评分测定结果见表2。

表2 羊乳发酵条件优化全因子试验设计及结果Table 2 Design and results of full factorial experiments for goat milk fermentation conditions optimization

采用JMP10 Pro软件对表2中的数据结果进行分析，得到ACE抑制率、活菌数以及感官评分的方差分析。

2.1.1 ACE抑制率的方差分析

对混菌发酵羊乳ACE抑制率进行方差分析，结果见表3。

表3 发酵羊乳ACE抑制率的全因子试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of full factorial experiments results for ACE inhibition rate of fermented goat milk

由表3可知，菌株LB6和ST混菌发酵羊乳ACE抑制率的方差分析模型（P＜0.05）显著，各因素对ACE抑制率无显著影响（P＞0.05），影响顺序为B＞AB＞A＞BC＞C＞AC。

2.1.2 活菌数的方差分析

对混菌发酵羊乳的活菌数进行方差分析，结果见表4。

由表4可知，菌株LB6和ST混菌发酵羊乳活菌数的主要影响因素为发酵时间和菌株比例，其他因素无显著影响（P＞0.05）。各因素对活菌数的影响顺序为C＞A＞AC＞B＞BC＞AB。

表4 发酵羊乳活菌数的全因子试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of full factorial experiments results for viable counts of fermented goat milk

2.1.3 感官评价的方差分析

对混菌发酵羊乳的感官评价进行方差分析，结果见表5。

表5 发酵羊乳感官评价的全因子试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of full factorial experiments results for sensory evaluation of fermented goat milk

由表5可知，菌株LB6及ST发酵羊乳感官评价的主要影响因素为发酵温度与发酵时间的交互项（P＜0.01），其他项无显著性影响（P＞0.05）。影响顺序为BC＞C＞B＞AC＞AB＞A。

2.1.4 菌株LB6和ST混合发酵羊乳发酵条件的优化

发酵羊乳发酵条件的全因子试验优化结果如图1所示。

图1 羊乳发酵条件的主因子优化图Fig.1 Optimization of main factors for fermentation conditions of goat milk

由图1可知，根据预测刻画器，兼顾各项指标（ACE抑制率＞80%，活菌数和感官评价越大越好）得出，发酵羊乳的最优发酵工艺条件为菌株比例1∶1，发酵温度为42℃，发酵时间为3.5h。在此条件下，其ACE抑制率预测值为84.56%，活菌数OD600nm值为0.28，感官评价为7.29分。

对上述最佳条件进行验证试验，得其ACE抑制率、活菌数OD600nm值、感官评分分别为（78.37±0.53）%、0.22±0.01、（7.35±0.25）分，其中活菌数与预测值0.28相差较远，分析原因可能是活菌数受多种因素影响。其余项指标与预测值比较接近。

2.2 冷藏过程对混菌发酵羊乳的影响

2.2.1 冷藏过程中混菌发酵羊乳pH值、酸度和活菌数的变化

冷藏过程中，混菌发酵羊乳的pH值、酸度和活菌数测定结果见图2。

图2 冷藏过程中混菌发酵羊乳pH值、酸度和活菌数的变化Fig.2 Changes of pH value,acidity and viable counts of fermented goat milk by mixed fermentation during refrigeration

发酵羊乳中的活菌数会受多种因素影响，如冷藏温度、pH值和酸度以及各种菌种之间的作用等[22]，由图2可知，发酵羊乳的pH值随着冷藏时间的延长而降低。随着发酵时间的延长，样品冷藏0～7 d，pH值降低较慢，只下降了0.1（3.94～3.84）；但冷藏7～14 d下降速度变快，pH值降低0.6（3.84～3.24）；冷藏14 d后酸化速度变缓，在14～28 d内，pH值仅降低了0.1（3.24～3.14），由此可知，冷藏7～14 d是酸化发生的主要时期。

酸度基本与其pH值相对应，发酵羊乳的酸度随着冷藏时间的延长而逐渐增大。分析原因可能是在冷藏过程中，保加利亚乳杆菌LB6继续生长繁殖，菌体的生长消耗残存的乳糖产生乳酸，导致酸度进一步升高。因菌株LB6与ST的产酸能力较强[23]，故冷藏0～14 d，酸度一直迅速增长，冷藏14～28 d，酸度趋于稳定，酸度达到180°T。而国标GB.19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中规定酸牛奶的酸度≥70.0°T时终止发酵，酸乳制品的酸度应该在70.0～110.0°T。而本研究发现，酸牛奶的国标可以作为参考，但并不能完全适用于发酵羊乳。因为酸度在70.0～80.0°T时，不能使羊奶中的蛋白形成固体状酸凝乳。通过试验验证，酸羊乳发酵终止酸度应在90.0°T左右较合适，即使发酵羊乳冷藏后酸度达到150.0°T，在感官评价时依然可以接受。

在冷藏过程中，发酵羊乳的总活菌数随着冷藏时间的延长呈先增大后减小趋势。总活菌数在冷藏7d时达到最大值（OD600nm值=0.32）。虽然低温低酸的环境已经不再适合菌体的生长，但由于生长惯性，菌体数量在冷藏1～7 d内仍呈上升趋势。而随着冷藏过程中酸羊乳pH的下降和酸度的升高，菌体生长受到其代谢产物的抑制，则加剧了菌体的死亡，从而导致7～28 d内总活菌数逐渐下降。

2.2.2 冷藏过程中发酵羊乳ACE抑制率和感官评价的变化

ACE抑制率的大小直接关乎发酵养乳中ACE抑制肽活性的大小，ACE抑制率越大说明抑制肽活性越高，那么降血压的效果也就越好。综合色泽、气味、滋味、组织结构四项对发酵羊乳进行感官评价，发酵羊乳的ACE抑制率和感官评价见图3。

图3 冷藏过程中混菌发酵羊乳ACE抑制率与感官评价的变化Fig.3 Changes of ACE inhibition rate and sensory evaluation of fermented goat milk by mixed fermentation during refrigeration

由图3可知，在发酵3 d内，发酵羊乳的ACE抑制率有所增加，发酵3d时ACE抑制率达到76.16%，低于SHUGW等[24]以L.plantarumLP69单菌株发酵羊乳的ACE抑制率（84.27%），高于以L.bulgaricusLB6单菌株发酵的酸羊乳ACE抑制率（74.70%）；发酵3d以后，ACE抑制率逐渐减小；发酵28 d时，ACE抑制率下降至20.19%，说明在发酵过程中ACE抑制肽的损失相当严重，分析原因可能是冷藏过程中菌体破坏了抑制肽的生物结构。

发酵羊乳在冷藏3 d时，感官评分最高为8.24分，此时口感最佳，酸甜适中，膻味较轻；随着发酵的进行，酸化越来越严重，致使发酵羊乳过酸，使人无法接受，因此感官评价分数逐渐降低（7.83～7.23分）。

2.2.3 冷藏过程中发酵羊乳质构的变化

冷藏过程中发酵羊乳的质构特性变化结果见图4。

图4 冷藏过程中发酵羊乳质构特性的变化Fig.4 Changes of texture properties of fermented goat milk during refrigeration process

由图4可知，随着冷藏时间的延长，发酵羊乳的硬度、稠度、凝聚性和黏度均呈先增大后减小的趋势。其中，发酵羊乳的硬度在冷藏14 d时达到最大值（0.078 g），冷藏14～21 d内随着冷藏时间的延长硬度逐渐减小，21～28 d时硬度变化趋于平缓；发酵羊乳的稠度在冷藏7 d时，稠度达到最大，为1.43 g；而凝聚性与黏度分别在冷藏3 d（0.078 g）和7d（0.179g·s）时达到最大。本研究得到的发酵羊乳在4℃条件下冷藏期达到14 d时，发酵羊乳的质构特性最佳：硬度为0.078g、稠度为1.92g·s、凝聚性为0.078g、黏度为0.179g·s。3结论

全因子试验设计得到混菌发酵羊乳的最佳发酵条件为菌株比例LB6∶ST=1∶1，发酵温度42 ℃，发酵时间3.5 h。在此最优发酵条件下，发酵羊乳的ACE抑制率、活菌数OD600nm值和感官评分分别为78.37%、0.22、7.35分。在冷藏过程中，随着冷藏时间的延长，发酵羊乳的pH值逐渐减小，酸度逐渐增大，感官评分、ACE抑制率、活菌数、硬度、稠度、凝聚性与黏度均呈先增大后减小的趋势。