广西地区青年人肠道乳酸菌的分离及其发酵酸奶品质的评价

杨发容，董 蕴，单春会，蔡文超，郭 壮，张振东*

（1.湖北文理学院 食品科学技术学院，湖北 襄阳 441053；2.石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

酸奶是利用新鲜的动物乳或奶粉和白糖混匀，再加入菌种发酵的乳制品，发酵结束后经过低温冷藏而成[1]。酸奶能维持并改善人体肠道菌群平衡，降低人体胆固醇，有效改善便秘，还有预防衰老等作用。由于酸奶中的蛋白质易被人体消化吸收，能缓解乳糖不耐症，所以较适合儿童和病人食用[2]。酸奶因风味独特而多样，营养价值较高而越来越受到人们的欢迎。乳酸菌发酵剂是影响酸奶风味与滋味的主要因素之一[3]。采用不同的乳酸菌发酵剂发酵的酸奶，它们最终的质构、风味和口感会具有不同的特点[4]。

乳酸菌是一类革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，可以发酵糖产生乳酸的无芽孢类细菌[5]。自然界中的乳酸菌种类很多，包括乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、链球菌属（Streptococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）等多个属，在发酵食品中，人或动物的肠道等环境中都有分布[6]。本研究从6名广西青年人志愿者的粪便样品，通过倍比稀释涂布法，进行乳酸菌的分离与鉴定，并利用这些乳酸菌进行酸奶的发酵制作，评价酸奶的品质，以期寻找到发酵品质较好的乳酸菌菌株，为酸奶发酵剂的开发提供乳酸菌资源，并为酸奶行业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新西兰恒天然全脂奶粉：新西兰恒天然集团；胰蛋白胨、酵母粉、琼脂糖（均为生化试剂）、氯化钠（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；Axygen聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）清洁试剂盒：康宁生命科学吴江有限公司；rTaq脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL），10×PCR buffer（含有Mg2+），脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture（2.5 mmol/L），pMD18-T克隆载体：宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α：实验室保存；27F与1492R（10 μmol/L）：由金斯瑞生物科技有限公司合成。粪便样品：采集自广西青年人志愿者。

MRS固体培养基：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DG250厌氧工作站：英国DWS公司；Vetiri梯度基因扩增仪：美国AB公司；LXJ-IIB低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；PEN3电子鼻（配备W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S传感器）：德国Airsense公司；YXQ-L31-400立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SA-402B电子舌（配备CA0、C00、AE1、CT0和AAE测试传感器）：日本Insent公司：LC-20ADXR高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配备Inertsil C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））：日本日立公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统：美国ProteinSimple公司；CYB40-10S高压均质机：上海东华高压均质机厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离与纯化

粪便样品采集到样品瓶后，装入冰袋降温的样品箱，进行乳酸菌的分离。将粪便样品进行10倍梯度稀释，取10-5与10-6梯度的稀释液，涂布于含有1.0%的碳酸钙的MRS固体培养基上，置于厌氧（85%N2、5%CO2和10%H2）、37 ℃条件下培养48 h。使用经灼烧并冷却后的无菌接种环挑取菌落形态具有明显差异且具有透明圈的菌落，在MRS固体培养基中进行划线，待长出单菌落后，继续挑取单菌落划线培养，连续3次。待菌落纯化完成后，进行革兰氏法染色，并用光学显微镜镜检，同时进行过氧化氢酶试验。选取革兰氏染色呈阳性，具有透明圈的菌株为待定的乳酸菌菌株，使用30%甘油保存于-80℃冰箱[7]。

1.3.2 乳酸菌的鉴定

乳酸菌基因组DNA的提取参照MVE-OBIANG A等[8]的方法进行。以提取到的乳酸菌总DNA为模板，以16SrRNA基因通用引物27F与1492R[9-10]进行PCR扩增。PCR扩增体系[9]：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）4 μL，引物27F（10 mmol/L）1 μL，1492R（10 mmol/L）1 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板约10 ng，补充无菌纯水至50 μL。PCR扩增程序[9]：94℃、5min；94℃、45s，55℃、45s，72℃、90s，30次循环；72℃、10 min[11]。使用Axygen PCR清洁试剂盒纯化PCR产物后，使用克隆载体pMD18-T进行TA克隆，挑选阳性克隆子送南京金斯利生物技术有限公司测序。获得的序列在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）数据库进行比对，并选择序列相似度较高的乳酸菌模式种序列，使用MEGA 7.0进行系统发育树构建。

1.3.3 酸奶的加工工艺及操作要点[12]

热水（60℃）→原料（奶粉、白砂糖）→均质→95℃保温5min→降温至4℃→接入乳酸菌发酵剂→42℃发酵（pH至4.5终止发酵）→冷却后熟→成品

操作要点：首先称取23g奶粉和13g白砂糖，加入164mL加热至（60±1）℃的纯水，搅拌混匀并进行高压均质（一段20 MPa，二段4 MPa），然后将均质后的乳液保持在95℃、5min进行巴氏杀菌。待杀菌后冷却至42℃，按照5×106CFU/mL复原乳的比例接入活化乳酸菌发酵剂，同时设置未接菌处理作为对照组。将所有酸奶处理放入培养箱42℃条件下发酵24 h，待发酵至pH=4.5时将酸奶在冷水中迅速冷却以终止发酵，然后置于4℃保持24 h进行酸奶的后熟，得酸奶成品。

乳酸菌的活化：首先将存放在-70℃的冻存乳酸菌使用MRS液体培养基进行活化，连续活化3次，作为乳酸菌种子液。参照卫生部办公厅颁发的《可用于食品的菌种名单》[13]，选取分离到的23株乳酸菌中的20株菌作为酸奶乳酸菌发酵剂进行酸奶的发酵制作。

1.3.4 分析检测

（1）酸奶气味的检测

称取15 mL酸奶样品，移入样品瓶中，将样品置于55℃恒温水浴10 min，室温平衡30 min，然后参照杨成聪等[14]的方法使用电子鼻探头进行测定：设定清洗时间为150 s，探针插入时间5 s，自动调零时间5 s，测试时间60 s，注射流速120 mL/min，内部流速120 mL/min。

（2）酸奶滋味的测定

酸奶样品处理：取100 mL去离子水与50 mL酸奶样品混匀，室温条件下3 000 r/min离心10 min，用滤纸过滤离心后的上清液，并收集滤液。酸奶的滋味测定参照王玉荣等[15]的方法：用SA 402B电子舌测定酸奶样品的酸、苦、涩、咸、鲜、回味A（涩味的回味）、B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）等8个指标的相对强度。

（3）酸奶有机酸含量的测定

酸奶样品的前处理参照田辉等[16]的方法进行。样品前处理：取2 mL酸奶与50 μL 68%的硝酸混合，使用流动相定容至10 mL，10 000×g离心10 min。取上清液于试管中在121℃保持15min灭菌，10000×g离心10min，用枪头取上清液装于EP管中。用1mL注射器吸取中间层清液，经0.22μm滤膜过滤到进样瓶中约1.0 mL。

使用HPLC法进行有机酸的测定，色谱条件：色谱柱为 Inertsil C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量20 μL，柱温为30℃，紫外检测器检测波长设定为215 nm，流速为1.0 mL/min，流动相是pH=2.30的磷酸二氢钾溶液（浓度为0.01 mol/L）。

1.3.5 统计分析

获得的数据使用SPSS18.0分析，使用Origin8.5绘图。系统发育树使用MEGA7.0构建。使用主成分分析（principle components analysis，PCA）法对酸奶滋味与气味进行综合分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

部分乳酸菌的在MRS固体平板上生长2 d后的菌落形态与细胞形态见图1。

图1 部分乳酸菌分离株的菌落形态与细胞形态Fig.1 Morphology of cells and colonies of part isolated lactic acid bacteria

广西地区青年人粪便样品通过倍比稀释，使用MRS培养基分离得到23株菌。由于乳酸菌产生乳酸，能将加入到MRS培养基中的碳酸钙溶解掉，形成透明圈，所以将能形成透明圈，革兰氏阳性，过氧化氢酶测定结果为阴性的23株菌，初步判定为乳酸菌[17]，对其进行纯化与保存，进一步对分离到的乳酸菌进行形态学观察（见图1），分子生物学鉴定，并基于细菌16S rRNA基因进行了系统发育分析。

2.2 乳酸菌的鉴定

对分离菌的16S rRNA基因进行了PCR扩增，结果见图2。由图2可知，获得的PCR产物为1 500 bp左右，与细菌16S rRNA基因的大小相符，且条带整齐，明亮，满足下一步进行基因克隆的需求。将PCR扩增产物进行纯化、TA克隆，选取阳性克隆子进行测序，获得了这23株乳酸菌的16SrRNA基因的序列。将这些序列提交NCBI数据库进行比对，结果见表1，并构建了系统发育树，结果见图3。

图2 部分乳酸菌16S rRNA基因的PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of 16S rRNA gene from part isolated lactic acid bacteria

表1 乳酸菌的16S rRNA基因序列比对结果Table 1 Alignment results of 16S rRNA gene sequences of the lactic acid bacteria

续表

图3 乳酸菌基于16S rRNA序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequences

由表1和图3可知，菌株HBUAS54271、HBUAS54217、HBUAS54220、HBUAS54222、HBUAS54224、HBUAS54225、HBUAS54234、HBUAS54238、HBUAS54260、HBUAS54318、和HBUAS54292与发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的菌株同源性最高（＞99%），鉴定为发酵乳杆菌；菌株HBUAS54223、HBUAS54230、HBUAS54248、HBUAS54250、HBUAS54317、和HBUAS54285 6株菌与唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）模式菌的16S rRNA同源性最高，鉴定为唾液乳杆菌；菌株HBUAS54235和HBUAS54236与融合魏斯氏菌（Weissella confuse）模式菌的系统发育关系最近，鉴定为融合魏斯氏菌；菌株HBUAS54233和HBUAS54288与格氏乳杆菌模式菌ATCC 33323T的系统发育关系最近，鉴定为格氏乳杆菌（Lactobacillusgasseri）；菌株HBUAS54286与口乳杆菌（Lactobacillus oris）模式菌F0423T的菌株同源性＞99%，所以将其鉴定为口乳杆菌；菌株HBUAS54287与副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）模式菌的同源性最高，鉴定为副干酪乳杆菌。

本研究从广西青年人肠道共分离出23株乳酸菌，通过16S rRNA序列分析将这些乳酸菌鉴定为6个种，分别为发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、融合魏斯氏菌、格氏乳杆菌、口乳杆菌和副干酪乳杆菌。其中发酵乳杆菌有11株，占所分离菌株总数的48%，唾液乳杆菌有6株，所占比例为26%，格氏乳杆菌有2株，所占比例为9%，副干酪乳杆菌有1株，占所有菌株总数的4%，融合魏斯氏菌有2株，所占比例为9%，口乳杆菌有1株，占所有菌株总数的4%。选取其中的20株菌，进行酸奶发酵制作与品质评价，以探明这些乳酸菌的酸奶发酵特性。

2.3 不同乳酸菌发酵对酸奶气味的作用

酸奶气味是酸奶品质的重要组成部分。在酸奶发酵制作时，乳酸菌对酸奶气味形成的特性是筛选优良乳酸菌发酵剂的重要因素。因此对发酵完成的酸奶通过电子鼻进行了气味测定，结果见表2。

由表2可知，各传感器对添加不同乳酸菌发酵剂的酸奶样品有不同的响应值，其中传感器W1S、W1W的响应值的差异较大，极差值分别为6.98和5.37，表明传感器W1S、W1W针对甲烷、有机硫化物，与萜类气味物质具有较强灵敏性，且分离到的乳酸菌发酵酸奶过程中形成的甲烷、有机硫化物和萜类气味物质的差异较大。传感器W5S、W2S和W2W的响应值的极差值为1.72、2.73、1.78，说明对酸奶中的乙醇及氢氧化物也有一定的响应。而传感器W3C与W5C响应的极差值分别为0.65和0.75，经方差分析（anaylsis of variance，ANOVA），酸奶中芳香类物质的差异并不显著（P＞0.05）。

表2 不同乳酸菌发酵酸奶的气味分析结果Table 2 Analysis results of aroma of yoghurt fermented with different lactic acid bacteria

2.4 不同乳酸菌发酵对酸奶滋味的作用

有机酸是乳酸菌在发酵乳品过程中代谢产生的，是影响酸奶滋味的重要因素之一。因此本研究利用电子舌对不同乳酸菌发酵的酸奶样品的滋味品质进行了评价分析，各滋味指标的相对强度值如图4所示。

图4 基于电子舌技术的酸奶样品各滋味分析结果Fig.4 Analysis results of taste of yoghourt samples using electronic tongue

除外观色泽与气味品质外，滋味品质是另一项影响消费者食品感官体验的重要因素。通过电子舌这种智能味觉分析系统对酸奶样品的滋味品质进行了测定，酸奶样品各项滋味指标的相对强度值如图4所示。由图4可知，酸奶样品中鲜味指标的极差值＜1，说明不同乳酸菌对酸奶样品的鲜味影响较小。酸奶样品中酸味、苦味、涩味、咸味、后味A、后味B和丰度基本味的极差值均＞1，说明不同乳酸菌发酵制作的酸奶样品之间酸味、苦味、涩味、咸味、后味A（涩味的回味）、后味B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）基本味滋味品质差异较大，反映出所选取乳酸菌的酸奶发酵特性各异。在这些滋味的基本味中，酸味、后味A和丰度的极值最大，极差值分别达到了11.99、10.85、12.54，是乳酸菌对酸奶滋味品质影响的主要体现。

2.5 不同乳酸菌对酸奶有机酸的作用

由图5可知，本研究中发酵的酸奶样品中有机酸由乳酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸组成。其中酸奶样品中的乳酸与乙酸含量最高，乳酸含量为0.77～8.74g/L，乙酸含量为0.92～8.98 g/L，因此不同的乳酸菌发酵制作的酸奶的乳酸与乙酸含量差异较大。与之相反的是，柠檬酸、苹果酸，与琥珀酸的含量较低，柠檬酸含量为0～2.28 g/L，苹果酸为0～0.08 g/L，琥珀酸为0～0.69 g/L。

图5 酸奶样品有机酸分析结果Fig.5 Analysis results of organic acids in the yoghourt samples

酸奶样品中，副干酪乳杆菌HBUAS54287、唾液乳杆菌HBUAS54223与HBUAS54248、格氏乳杆菌HBUAS54233、发酵乳杆菌HBUAS54238与HBUAS54318发酵制作的酸奶中乳酸含量最高，均＞5.5g/L，显著高于其他样品（P＜0.05），说明它们发酵产生乳酸能力较强。同时这些乳酸菌发酵的酸奶样品，除唾液乳杆菌HBUAS54248与发酵乳杆菌HBUAS54238外，样品中乙酸含量均＜2g/L。因此，由于本次分离到的乳酸菌发酵产生芳香类物质的差异不大，根据其乳酸发酵特性，副干酪乳杆菌HBUAS54287、唾液乳杆菌HBUAS54223与HBUAS54248、格氏乳杆菌HBUAS54233、发酵乳杆菌HBUAS54238与HBUAS54318都是适用于酸奶发酵的候选发酵剂的开发菌株。

2.6 基于酸奶滋味与气味的PCA分析

本研究利用主成分分析软件SAS评价了乳酸菌对酸奶口感品质的影响。主成分1和主成分2的2因子载荷图如图6所示。由图6可知，第一主成分由酸味、涩味和后味A（涩味的回味）3个酸奶特征性滋味指标构成并且占全部变量的44.64%，各传感器与特征性滋味指标分布在各个象限，传感器W1W与W2W的分离度较明显，与W5S的分离度则不明显。而第一主成分传感器响应实验主要分布在第二、三、四象限，其中对芳香类物质较敏感的传感器都在第四象限且分离度不明显。

酸奶滋味品质的主成分1与主成分2因子得分图如图7所示。由图7可知，由酸奶样品中各主成分的方差贡献率和特征值可得出，前4个主成分的累积方差贡献率为86.55%。11株发酵乳杆菌HBUAS54217、HBUAS54225、HBUAS54292、HBUAS54318、HBUAS54220、HBUAS54271、HBUAS54224、HBUAS54222、HBUAS54238、HBUAS54260与HBUAS54234发酵的酸奶样品聚集分布在最左侧（第二与第三象限），9株唾液乳杆菌HBUAS54285、HBUAS54233、HBUAS54287、HBUAS54317、HBUAS54248、HBUAS54223、HBUAS54288、HBUAS54250和HBUAS54230发酵的酸奶聚类分布在最右侧（第一与第四象限）。2株格氏乳杆菌HBUAS54233与HBUAS54288发酵的酸奶样品分别在第一与第四象限，距离较近。结果表明，属于同一分类单元的乳酸菌，发酵产生的酸奶滋味与气味较为接近，在因子载荷图上呈现出集中的趋势，可能是因为其基因组成相近，代谢类型相似。因此，要使酸奶具有多样的滋味与风味，就需要多种乳酸菌进行复合发酵。

图7 基于酸奶滋味与气味的主成分分析因子得分图Fig.7 Factors score chart by PCA based on the taste and aroma of the yoghourt

3 结论

本研究表明，广西青年人肠道乳酸菌多样性较高，从6名志愿者粪便样品中共分离得到23株乳酸菌，鉴定为魏斯氏菌属和乳杆菌属共2个菌属，6个种，其中有11株被鉴定为发酵乳杆菌，占到总分离菌的47.83%。对酸奶品质的分析表明，使用所分离到的乳酸菌发酵制作的酸奶样品间芳香类物质无显著差异（P＜0.05），而酸味具有较大差异。进一步分析表明，酸奶样品酸味的差异由有机酸乳酸与乙酸的含量引起，其中副干酪乳杆菌HBUAS54287、唾液乳杆菌HBUAS54223与HBUAS54248、格氏乳杆菌HBUAS54233、发酵乳杆菌HBUAS54238与HBUAS54318乳酸产生能力较强，可用于酸奶发酵的复合发酵剂乳酸菌的筛选。多元统计分析表明，采用分离到的属于同一分类单元（种）乳酸菌发酵制作的酸奶，气味与滋味相似，在基于PCA的载荷图上分布集中。