慢性疼痛共患抑郁症的神经环路

一、研究背景

慢性疼痛与抑郁症共病现象在临床上很常见，这导致共病的病人更难治疗。抑郁症状可以导致疼痛时间延长和程度加深，从而使疼痛和抑郁症状之间产生恶性循环。找到有效的治疗CDS的措施仍然是此领域面临的巨大挑战。以往的研究表明，5-HT能系统功能异常参与抑郁和慢性疼痛。在疼痛调节的下行通路中，广泛认为5-HT系统下行调节疼痛感觉。疼痛也受到多个中枢脑区的调节，如丘脑、杏仁体、内侧前额叶和岛叶等，其中多个区域接受5-HT的上行投射。但是，慢性疼痛是否以及如何影响5-HT的上行投射系统并调节抑郁的中枢机制还很不清楚。在中枢神经系统中某些脑区，如杏仁核和DRN既参与慢性疼痛也参与抑郁症的调节。在神经解剖结构上，慢性疼痛和抑郁症状之间如何关联还知之甚少。慢性疼痛时上行5-HT能神经系统功能改变是否导致CDS并不清楚。众所周知，杏仁复合体与恐惧学习、焦虑以及疼痛等相关。杏仁体中央核(CeA)被称为“痛觉杏仁体”，是杏仁体主要的功能输出部位。深度加工的、多模态的信息从丘脑、皮质和脑干到达CeA，CeA再与前脑和脑干的脑区相连，参与恐惧和情绪加工。以往的这些结果提示CeA可能是慢性疼痛和抑郁的交汇点。然而，CeA环路的适应性改变和CDS的发病机理之间的因果关系尚不清楚。基于杏仁体和5-HT系统均参与调节疼痛和抑郁症状，该文研究了介导CDS的CeA环路机制以及慢性疼痛状态下5-HT系统在环路中的作用和对抑郁样行为的调节。

本研究结合病毒追踪、电生理学、光遗传学、化学遗传学等方法，剖析了DRN→CeA神经环路的功能性组合，探讨了这条神经环路在慢性疼痛雄性小鼠中适应性改变的原理。此外，本研究还运用静息态功能性磁共振成像评估了这种小鼠模型中的神经环路与CDS病人的环路的相关性。

二、主要结果

1.5-HT1ARs介导5-HTDRN→SOMCeA抑制性神经通路

杏仁体CeA部位95%神经元含有抑制性神经递质GABA。研究首先用Cre依赖的逆向跨单突触病毒追踪方法，显示谷氨酸脱羧酶2（glutamic acid decarboxylase 2，GAD2，编码GABA合成酶的基因）-Cre小鼠CeA部位GABA神经元上一级输入神经元。除了已经熟知的输入部位，如杏仁体基底外侧部（BLA）和丘脑室旁核；本研究还发现DRN核团中有DsRed标记的神经元，说明DRN中神经元能支配CeA部位的GABA能神经元。这个结果非常有意义，因为已知5-HT系统参与调节抑郁症，常用的抗抑郁药，如帕罗西汀等，均是作用于这个系统发挥抗抑郁效果。

研究进一步明确了CeA部位GABA抑制性神经元三种亚型(PV、CR、SOM)的输入环路。研究使用了小清蛋白(parvalbumin, PV) -Cre、钙结合蛋白(calretinin, CR) -Cre、生长抑素(somatostatin,SOM) -Cre三种转基因小鼠，将Cre依赖的逆向跨单突触病毒注射于CeA部位。结果显示DRN中DsRed标记的神经元只出现在SOM-Cre小鼠中，并且通过免疫荧光染色鉴定发现DsRed标记的神经元是5-HT能神经元。为进一步明确这个结果，作者用依赖Cre表达光敏感通道蛋白2 (AAV-DIOChR2-mCherry)注射到Pet1-Cre小鼠（Cre只在5-HT能神经元中表达）的DRN中，4周后切片结果显示CeA部位有很多mCherry阳性纤维，并且所有的mCherry阳性神经元对蓝光(473 nm)刺激敏感，95%的mCherry阳性神经元是5-HT神经元。上述结果显示5-HTDRN神经元与SOMCeA神经元形成单突触联系。

用SOM-Cre和Pet1-Cre小鼠分别与Ai9小鼠杂交，在全细胞膜片钳记录脑片上分别标记出SOM-tdTOM和5-HT (Pet1-tdTOM)能神经元。来自DRN的神经纤维投射到SOMCeA神经元的近侧树突和胞体上。蓝光刺激5-HTDRN神经元上ChR2诱导SOMCeA神经元产生超极化电流，此电流被5-HT1AR拮抗剂翻转。形态学分析也显示62.3%的5-HT1AR免疫信号在SOMCeA神经元上。

为了确认光操控CeA部位5-HTDRN神经纤维足以影响SOM阳性神经元的活动，本研究检测了光刺激5-HTDRN末梢后SOMCeA神经元的动作电位频率和c-Fos的表达。光抑制CeA部位5-HTDRN神经纤维增加c-Fos表达，其中74.7%的c-Fos和SOM免疫荧光共标。全细胞膜片钳记录显示光兴奋CeA部位5-HTDRN神经纤维降低SOMCeA神经元放电频率，这种作用被5-HT1AR拮抗剂阻断。相比之下，光刺激CeA部位5-HTDRN神经纤维诱导SOM阴性神经元去极化，这种作用被5-HT2AR拮抗剂阻断。免疫荧光显示79.3%的5-HT2AR表达于SOM阴性神经元。光兴奋CeA部位5-HTDRN神经纤维增加SOM阳性神经元的mIPSCs频率，5-HT2AR拮抗剂阻断了这种增加的mIPSCs频率。上述结果提示5-HTDRN神经纤维投射到SOMCeA神经元，导致其超极化；CeA部位SOM阴性神经元抑制局部的SOM阳性神经元。

2.慢性疼痛小鼠脑内5-HTDRN→SOMCeA神经通路发生去抑制

为了研究5-HTDRN-SOMCeA环路在CDS中的作用，本研究采用了保留性坐骨神经损伤(Spared nerve injury, SNI)诱导的神经病理性疼痛和完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant, CFA)诱导的炎症性疼痛模型。SNI后6周和CFA注射后3周，小鼠产生了明显的抑郁样行为。在Pet1-tdTOM小鼠CeA部位注射CTB-488标记投向CeA部位的DRN中5-HT神经元，电生理记录这些神经元显示SNI后6周时放电数目减少。在体微透析也检测到CeA部位的5-HT浓度在SNI后6周时减少。

如果SOMCeA神经元被5-HTDRN神经元输入抑制，那么在慢性疼痛时这种输入减弱将去抑制SOMCeA神经元。研究观察到SNI后6周时SOM阳性神经元的发放频率增加了，但静息膜电位没变化。用化学遗传抑制SNI后6周时SOM阳性神经元的活动减轻了抑郁样行为。

3.5-HTDRN→SOMCeA神经环路在慢性疼痛伴抑郁样行为中发挥充分必要作用

考虑到慢性疼痛时5-HTDRN→CeA的输入减少，本研究用化学遗传方法兴奋5-HTDRN神经元，发现SNI诱导的抑郁样行为得到缓解，这种作用被局部CeA注射5-HT1AR拮抗剂阻断。光遗传激活CeA部位的5-HTDRN神经末梢产生了相似的作用，同时还恢复了SNI诱导的痛阈值的降低。在正常小鼠中，光抑制CeA部位的5-HTDRN神经末梢产生了抑郁样行为。CeA局部注射5-HT1AR激动剂明显缓解了SNI诱导的抑郁样行为。但是CeA局部注射选择性5-HT重摄取抑制剂(SSRIs)则没有这种效果。慢性束缚应激(CRS)和慢性社会斗争失败应激(SDS)两种抑郁模型中CeA部位5-HT含量不变。光激活5-HTDRN→SOMCeA神经环路也不影响CRS和SDS诱导的抑郁样行为。这些结果提示5-HTDRN→SOMCeA神经环路参与调解慢性疼痛诱导的抑郁样行为，而非其它应激诱导的抑郁症。

4.外侧缰核作为5-HTDRN→SOMCeA环路的输出部位调控小鼠慢性疼痛伴抑郁样行为

AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒注射到SOMCre小鼠CeA部位，在外侧缰核（LHb，参与抑郁的核团）观察到大量的mCherry阳性纤维。出乎意料的是，光兴奋LHb中SOMCeA神经末梢能诱导出近一半(12/25)的LHb神经元产生兴奋性突触后电流(EPSCs)和抑制性突触后电流(IPSCs)。但是也有近一半(11/25)的LHb神经元只有EPSCs，只有极少数(2/25)的LHb神经元只有IPSCs。在GAD2-Cre和CaMKII-Cre小鼠的LHb注射逆向跨单突触病毒，结果显示CeA部位中DsRed标记的神经元只在CaMKII-Cre小鼠中观察到，在GAD2-Cre小鼠中并未观察到。CeA部位中DsRed标记的神经元与SOM和VGLUT2共标，而且绝大多数(82.9%)DsRed神经元有5-HT1AR，很少(9.6%)有5-HT2AR。顺行跨单突触病毒结合免疫荧光也证明了SOMCeA在LHb下一级神经元是VGLUT2阳性。电生理记录显示SNI后6周时LHb中CaMKII阳性神经元放电增加。光遗传激活LHb中SOMCeA神经末梢使正常小鼠出现抑郁样行为，相反光抑制SOMCeA神经末梢使SNI后6周小鼠抑郁样行为减轻。

为了证明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb环路的联系，研究者在LHb注射逆向AAV (AAV2/2Retro-CMV-bGl-Cre-EGFP)使得SOMCeA神经元表达Cre-GFP，再在CeA部位注射Cre依赖的逆向跨单突触病毒。结果显示DRN中出现了很多DsRed阳性神经元，并且是5-HT阳性。为了证明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb环路的功能，研究者用SOM-tdTOM小鼠在LHb注射CTB-488来标记投射到LHb的SOMCeA神经元，DRN注射AAV-hSyn-ChR2-mCherry。脑片电生理记录发现光兴奋CeA中5-HTDRN纤维诱导CTB-488标记的SOM阳性神经元超极化，这种作用被5-HT1AR阻断。这些CTB-488标记的SOMCeA神经元在SNI后6周兴奋性增加，且不受5-HT2AR拮抗剂的影响。这些结果说明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb环路可能参与调解CDS病人的抑郁样行为。

5.CDS病人DRN和CeA的功能连接减弱

研究进一步运用静息态fMRI评估了该环路在疼痛抑郁共病的病人是否也发挥作用。与没有慢性疼痛的抑郁症病人相比，CDS病人的杏仁体中央内侧核(CM)与多个脑区（包括DRN）间的功能连接降低。尤其是DRN-CM通路的功能连接降低只出现在慢性疼痛共病抑郁病人。在无慢性疼痛的抑郁症病人和慢性疼痛无抑郁症的病人不存在这种降低。而且在慢性疼痛共病抑郁病人，这个通路的功能连接与抑郁量表呈负相关。这些结果提示慢性疼痛病人的DRN-CM连接和抑郁症状有关联。

三、讨论

选择性5-羟色胺再摄取抑制药(SSRIs)对慢性疼痛共患抑郁症状(CDS)病人的治疗效果远不能令人满意，这表明CDS中涉及一种独特的神经环路机制。与这一现象相一致，本研究证明在杏仁体的中央核(CeA)注射帕罗西汀对慢性疼痛小鼠的抑郁样行为没有明显影响。相比之下，激活CeA中5-HT1ARs能减少这些小鼠的抑郁样行为，表明5-HT1ARs 介导的5-HTDRN→SOMCeA神经环路可能在慢性疼痛引起的抑郁样行为中发挥作用。SSRIs通过至少14种5-羟色胺(5-HT)受体亚型调节整个大脑的5-HT能系统，因此，SSRIs对多种5-HT受体亚型的整体作用，可能导致无法有效治疗CDS病人。事实上，SSRI抗抑郁药的确切靶点仍然难以确定。因此，单一的5-HT受体亚型，如5-HT1ARs，可能作为开发治疗CDS病人的抗抑郁药的新靶点。

研究疾病的神经环路的优点是能够揭示影响药物作用和病理性行为后果的共同位点。本研究提出了一种导致CDS的神经环路的假设，即慢性疼痛通过SOMCeA神经元上的5-HT1ARs导致5-HTDRN→SOMCeA神经环路的去抑制，并且由此产生的LHb神经元活动增强导致抑郁症状。已经发现CDS以一种状态依赖性方式出现，伴随着CeA中5-HT的降低和SOMCeA神经元活性逐渐增加。疼痛的持续时间对于动物的抑郁很重要，因为小鼠在SNI手术后6周才表现出抑郁样行为。这种行为结果可能归因于进行性疼痛期间的动态网络活动。5-HTDRN→SOMCeA神经环路在SNI慢性疼痛模型6周小鼠中的适应变化改变了LHb的活动，从而促进了抑郁样行为的发生。研究发现激活5-HTDRN→SOMCeA神经环路减轻了慢性疼痛小鼠的抑郁样行为，但对慢性应激小鼠引起的抑郁行为没有影响，表明这种神经环路可能只在慢性疼痛时参与。这一点与临床的fMRI的数据一致。基于来自动物和临床的数据，本研究提供了关于该神经环路的行为功能的跨物种转化研究。

包括DRN在内的脑干是将伤害性信息传送到脑更高中枢的关键脑区。然而，上行的5-HTDRN神经系统是否调控CDS仍然不清楚。CeA神经微环路的系列结构提示，SOM阳性神经元的活动稳态至少部分由5-HTDRN输入精细控制。5-HTDRN投射主要通过突触后5-HT1ARs介导超极化过程抑制CeA中SOM阳性神经元，而通过突触后5-HT2ARs兴奋SOM阴性神经元。所以在持续疼痛状态下，SOMCeA神经元的高活动性由双重去抑制驱动；即通过直接削弱突触前5-HTDRN输入和减弱局部SOM阴性神经元功能。此外，5-HTDRN适应不良促进谷氨酸能突触传递的机制可能涉及平行途径，例如，从外侧杏仁体到CeA部位SOM阳性神经元。由于SOM阳性神经元活动受突触前5-HT的调节，5-HTDRN→SOMCeA神经环路的不良适应可能在慢性疼痛状态下持续存在。这种复杂的情况可能是CDS病人抗抑郁治疗效果不好的原因。

LHb接收来自许多参与应激反应的大脑区域的投射，这些投射可能介导抑郁的不同症状。以往的研究表明，在抑郁症动物模型中，LHb谷氨酸能神经元的突触传递增强。本研究结果表明，SOMCeA神经元主要通过谷氨酸能投射支配GluLHb神经元。因此，患有慢性疼痛和抑郁样症状的小鼠中，可能通过增加的SOMCeA谷氨酸能输入激活GluLHb神经元活动。该假设支持缰核神经元的突触效能增强促进啮齿动物的抑郁样行为的观点。因此，我们提出尽管LHb是抑郁病理生理学的共同区域，但5-HTDRN→SOMCeA神经环路的细胞类型特异性调节的改变可能是治疗耐药性抑郁症发展的普遍机制，包括CDS。此外，尽管5-HTDRN→SOMCeA神经环路可能有助于多种行为产生，如恐惧、焦虑和抑郁，但该环路对LHb的特定投射可能参与慢性疼痛诱导的抑郁样行为。这些发现说明抑郁症的不同病因，例如慢性疼痛和压力应激，可能由不同的神经环路编码。

本研究发现激活5-HTDRN→SOMCeA神经环路缓解了疼痛症状。这种效应可能涉及杏仁体介导的下行疼痛控制系统。由于治疗CDS的药理学选择仍然有限，这些发现提示使用非药物疗法如深部脑刺激或经颅磁刺激靶向整合性神经通路治疗CDS的可能性，从而更好的治疗这类疾病。