结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤基因异常与转化医学的研究进展△

齐菲，董梅

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院内科，北京100021

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤（extranodal natural killer/T-cell lymphoma，nasal type，NKTCL）是成熟（外周）T细胞或自然杀伤（natural killer，NK）细胞淋巴瘤的一个重要病理亚型，主要起源于NK细胞，少数起源于细胞毒性T细胞[1]。NKTCL发病具有明显的地域差异，西方国家少见，但却是亚洲最常见的成熟T细胞或NK细胞淋巴瘤（22.4%）[2]。NKTCL常见于上消化呼吸道等结外部位，尤其是鼻腔和韦氏环；上消化呼吸道以外常见原发部位为消化道、皮肤、皮下组织、睾丸等[3]。其组织学上表现为伴随肿瘤细胞浸润的、血管中心性坏死性病变。免疫组化可见CD3ε（细胞质）、CD56、细胞毒标志物（颗粒酶B、穿孔素、TIA-1）阳性，sCD3（细胞膜）、CD5阴性，但是无T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）基因重排（起源于 NK细胞者）。原位免疫杂交（in situ hybridization，ISH）可见NKTCL肿瘤细胞EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）编码RNA阳性，提示EBV感染在NKTCL发病中可能具有重要意义，但其病因学及分子病理机制尚未完全明确[4]。

NKTCL总体上表现为恶性进展性疾病。近年来，随着放疗技术的进步、化疗方案的优化以及造血干细胞移植技术的进步，早期NKTCL患者的生存情况明显改善，5年总生存率（overall survival，OS）可达64%～88%[5]。然而，NKTCL是一种异质性疾病，预后不一，即使接受放化疗联合治疗，仍有10%～30%的早期患者出现治疗失败（局部复发或远隔部位转移）[6]；此外，约20%的患者初治时即为晚期。治疗失败或晚期NKTCL患者的疾病进展迅速，预后差，5年OS仅为0～20%[7]。

目前认为，年龄、分期、B症状、美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分、局部淋巴结受侵等因素与NKTCL预后相关。NKTCL预后评价系统包括美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推荐的预后评分和Nomogram预后模型[8-9]。NCCN指南推荐的预后评价系统包括年龄＞60岁、Ⅲ/Ⅳ期、非鼻腔病变、远处淋巴结受侵和EBV-DNA载量[8]。Nomogram模型包含年龄、ECOG评分、分期、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、局部淋巴结受累（Ⅱ期）及肿瘤外侵5个危险因素，可以准确预测5年生存率，同时对临床治疗模式的选择具有重要指导意义[9]。上述预后评分系统具有良好的临床应用价值，但均由临床因素构成，因此可能具有一定的局限性。

目前淋巴瘤基因水平的研究及成果主要集中在B细胞淋巴瘤。研究证实，滤泡性淋巴瘤中存在7个常见基因突变，并对预后有不同程度影响；将异常基因与临床因素[滤泡性淋巴瘤国际预后指数（follicular lymphoma international prognostic index，FLIPI）+ECOG评分）]相结合而建立的m7-FLIPI模型已被NCCN指南推荐用于滤泡性淋巴瘤患者预后风险分层[10]。随着基因检测技术的进步及应用的推广，NKTCL相关基因改变的研究也方兴未艾。结合目前研究进展推测，NKTCL中可能存在某些特定基因改变参与疾病的发生、进展及预后，对特定基因改变的认识可能有助于精准治疗及预后评价。本文对目前NKTCL相关的基因异常作简要综述，归纳常见的基因改变及潜在靶向治疗进展，初步探讨基因异常在转化医学中的意义。

1 概述

1.1 NKTCL常用基因检测方法

目前，国内外针对NKTCL基因水平的研究均以福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片和（或）细胞系为检测标本，主要采用微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，Array-CGH）技术和DNA测序（gene sequencing）技术进行检测。Array-CGH可以快速全面地分析某个特定染色体、基因组的一段区域或全基因组的DNA拷贝数的变化。DNA测序技术，尤其是二代DNA测序（next-generation sequencing，NGS）技术，包括全基因组、全外显子、目标区域（靶基因）测序，检测通量大、耗时短、精确度高，被越来越多地应用于NKTCL研究领域。此外，基因表达谱（gene expression profiling，GEP）、ISH、免疫组化、微小RNA（microRNA，miRNA）检测等技术也被用于基因转录后水平的检测。RNA干扰技术可在转录后水平沉默目标基因，反方向验证特定基因的功能。上述不同水平的技术结合研究将有助于异常基因的确定、基因功能的分析。

1.2 NKTCL基因研究现状

对NKTCL基因异常的研究主要集中于亚洲国家，尤其是中国、日本、韩国及新加坡，此外法国、西班牙、美国等国家及地区也有相关研究。由于NKTCL的发病率低、肿瘤组织坏死严重、取材困难等原因，已有研究绝大部分为小样本探索性研究。

已发表的研究结果显示，与其他淋巴造血系统肿瘤类似，在NKTCL中也常伴随许多基因改变，但目前尚未发现特定的染色体易位[11-13]。基于NKTCL高异质性，且各研究中诊断标准、取材方法及部位、基因检测方法、检验试剂等的差异，目前尚无明确统一的基因异常结果。NKTCL异常基因改变复杂多样，涉及细胞因子、细胞基质、生长因子及受体、癌基因与抑癌基因等，参与细胞周期调控、细胞凋亡、表观遗传学以及多种信号通路等[11]。目前最大样本量NKTCL基因异常的研究来自中国，Jiang等[14]应用全基因组测序方法确定了25例NKTCL患者肿瘤组织常见的体细胞突变，随后采用靶基因测序在80例NKTCL患者中进行了验证。研究发现，RNA解旋基因DDX3X是最常见的基因突变（20%），其次是抑癌基因TP53、MGA、JAK-STAT通路的STAT3和STAT5B，以及表观遗传调控基因MLL2、ARID1A、EP300和ASXL3等。Array-CGH研究显示，NKTCL患者存在多种染色体异常，如 1q23.1-q24.2、1q31.3-q44获得，7p15.1-p22.3、17p13.11 缺失[12]。此外 4q、6q、7q、11q、12q和15q缺失，2q、10q和13q获得也是常见的染色体异常改变[13]。其中，6q21-q25缺失可能是最常见的染色体异常，涉及PRDM1、BLIMP1及FOXO3等多项靶基因改变[15]。

针对特定靶点或通路的药物研究为NKTCL患者的治疗提供了新的思路。zeste基因增强子的人类同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）抑制剂（ZLD10A）、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）抑制剂（雷帕霉素）及Janus激酶3（Janus kinase 3，JAK3）抑制剂（tofacitinib）等对NKTCL的抑制作用已得到体内外试验的证实[16-19]。

2 NKTCL相关的基因突变

2.1 EBV相关基因

EBV属于疱疹病毒家族成员，主要攻击B淋巴细胞，也可感染NK或T细胞[20]。几乎100%的NKTCL可见EBV感染。目前普遍认为EBV是NKTCL重要的致病因素[21]。治疗前后外周血EBV-DNA滴度、EBV-EA-IgA及VCA-IgA水平可能是NKTCL疗效、复发风险及预后的重要预测因子[22-25]。

EBV病毒感染后，其基因组可嵌入宿主细胞中，诱导细胞产生各种抗原，包括EBV编码核抗原（EBV-determined nuclear antigen，EBNA）、潜伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP）1、LMP2A、LMP2B以及EBV编码RNA（EBV-encoded RNA，EBER）等[26]。其中，LMP1蛋白被认为是EBV相关蛋白中最重要的癌蛋白。LMP1蛋白破坏细胞信号转导通路，导致靶细胞的增殖和细胞程序性死亡的同步破坏，活化核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）和Janus激酶/信号转导及转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）通路，促进细胞转化和永生[26-28]。LMP2A主要参与细胞周期及凋亡通路等细胞通路的调节，促进肿瘤形成和抗肿瘤细胞凋亡。Mao等[26]分析了16例NKTCL组织标本的免疫组化结果，发现在肿瘤细胞中可见LMP1和LMP2A高表达（56.25%和 43.75%），LMP1或LMP2A高表达患者的总体预后与LMP1或LMP2A低表达者比较，差异均有统计学意义（P=0.049、0.036）。Sun等[29]的研究评估了LMP1基因在NKTCL中的作用，证实LMP1基因通过诱导survivin表达，抑制NF-κB和PDK/AKT通路，实现抑制肿瘤细胞凋亡的作用。该研究显示，人EBV阳性的细胞系SNK-6和 SNT-8转染LMP1（pcDNA3.1-LMP-1）基因后，细胞凋亡率分别增加了10.31%和12.05%；而敲除LMP1基因（转染LMP1siRNA）后，SNK-6和SNT-8细胞的凋亡率分别减少了41.48%和35.63%；分别用survivin、PI3K/AKT、NF-κB抑制物处理细胞后，survivin表达下降，细胞凋亡率有所减少。

目前，EBV感染及EBV感染相关肿瘤的治疗主要包括抗病毒、基因及相关治疗、主动及被动免疫治疗等。基因及相关治疗包括针对CCR4、PI3K/AKT/MTOR、NF-κB等EBV致病通路的抑制剂，目前多处于临床前试验阶段。EBV肿瘤病毒疫苗（主动免疫）和过继性免疫治疗的研究取得较大进展，某些正在进行I/Ⅱ期临床试验[29-33]。针对EBV相关抗原的疫苗如EBNA-1（US20060188520、US7442377B2）、EBNA-2（US20060257356A1、7422751）、LMP1（US20070048329）等，可用于EBV感染及相关肿瘤的预防及治疗[31]。韩国的一项临床研究证实，针对LMP1/2A的过继性免疫治疗可能是NKTCL治疗的一种安全且有效手段[32]。该研究共纳入经诱导治疗后缓解±后续放疗的NKTCL患者10例，患者接受经LMP1/2A诱导产生的抗原特异性细胞毒T细胞（LMP1/2A CTL）回输，中位随访55.5个月后，4年总生存率及无复发生存率分别为100%和90%。对EBV感染致病以及机体获得保护性免疫的机制的准确认识可能是目前免疫治疗面临的主要问题。

2.2 EZH2基因

组蛋白修饰是表观遗传调控的主要机制之一，在肿瘤的发生中起重要作用[34]。多梳抑制性复合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一个作用于组蛋白H3赖氨酸位点K27（H3K27）的高度保守的组蛋白甲基转移酶，其中EZH2是PRC2的催化亚基[35]。PRC2参与H3K27的甲基化，通过改变染色体结构，使组蛋白和DNA的结合更加密实，影响相应基因的转录表达[36]。生理情况下，PRC2参与胚胎的正常发育以及T、B淋巴细胞的分化。10%的非霍奇金淋巴瘤可见SET结构域Tyr641和Ala677 突变[18，37]。EZH2突 变通常引起 NKTCL 患者组蛋白异常甲基化、PRC2靶基因沉默（包括BLIMP1、IRF4、PRDM1等）[36]。目前临床前试验已证 实 PRC2/EZH2抑 制 剂（DZNep、EPZ005687、GSK343、UNC1999、ZLD10A等）对EZH2突变相关T/B淋巴瘤细胞系的抑制作用，I期临床试验（GSK126）、I/Ⅱ期临床试验（EPZ-6438）正在进行中[18，38-42]。

在NKTCL中，EZH2的过表达可能并非来自于EZH2基因改变。Yan等[43]对38例NKTCL肿瘤组织和正常NK细胞进行免疫组化及染色质免疫沉淀对比分析，结果显示EZH2在NKTCL中高表达（61%），在正常NK细胞中表达水平明显减低（＜5%），但在高表达EZH2的NKTCL中并未发现EZH2基因异常改变。进一步研究发现，NKTCL存在某些miRNA如miRNA-26a、miRNA-26b和miRNA-101，它们可以特异性结合EZH2基因的保守序列，降低基因转录水平。而在NKTCL中，MYC基因的激活可引起上述miRNA的下调，继而引起EZH2的高表达。上述结果提示，EZH2的过表达可能来自于上述miRNA的下调。采用RNA干扰技术针对转录后水平的调节可能是EZH2过表达NKTCL的另一治疗靶点。

EZH2除影响组蛋白甲基化抑制基因转录外，还有复杂的非组蛋白依赖性致癌作用。Yan等[44]发现，JAK3可磷酸化EZH2蛋白，促使其从PRC2上分离，降低H3K27me3水平；同时磷酸化的EZH2蛋白作为转录共刺激分子，上调与DNA复制、细胞周期、生物合成、干细胞转化及肿瘤浸润相关的基因；JAK3抑制剂可明显减少NKTCL细胞系的增殖。由此可推测，JAK3及相关通路有望成为EZH2过表达NKTCL患者治疗的新靶点。

2.3 PRDM1基因

有研究报道，约40%的NK或T细胞淋巴瘤组织中可见6q21缺失，引起一些重要抑癌基因缺失，包括PRDM1、ATG5、ATM1、FOXO3和HACE1等[45-46]。

PRDM1，也称Blimp-1，是一种具有锌指结构的转录抑制因子，被认为是B细胞向浆细胞分化的最终调控因子[47]。许多研究表明，PRDM1基因失活在NKTCL中广泛存在，与NKTCL发病有密切关系[45-46]。许多关于NKTCL肿瘤组织或细胞系的研究发现，PRDM1蛋白低表达不仅见于PRDM1基因缺失者，无PRDM1缺失或突变、PRDM1高转录者也存在PRDM1蛋白低表达[45，48]。由此可见，PRDM1致病机制复杂，可能涉及基因及表观遗传学等多方面异常。目前认为，PRDM1失活有如下机制：6q21缺失引起的PRDM1基因缺失、DNA甲基化（PRDM1前体CpG甲基化）、miRNA抑制（miRNA-9、miRNA-30b和miRNA-223）、其他转录抑制因子（BCL-6、LMP1）及信号通路的异常等[45-46，48-49]。

PRDM1是NKTCL致病相关的重要抑癌基因。正常NK细胞PRDM1基因敲除后细胞增殖明显增加；相反，转入PRDM1基因后PRDM1表达增加，肿瘤细胞停滞在G2/M期，促进细胞凋亡[45]。此外，PRDM1的表达可能会影响细胞增殖相关的基因表达MYC、4-1BBL以及TNF-α的表达，同时也对细胞周期负性调节因子CCNG1和CCNG2的表达产生影响[45]。针对PRDM1失活的基因添加、DNA去甲基化、RNA干扰治疗，以及相关基因的调节可能成为PRDM1异常改变的NKTCL治疗新手段。

2.4 JAK 3/STAT相关基因

JAK属于细胞质内非受体酪氨酸激酶，介导细胞因子（如白细胞介素-2，白细胞介素-7）、生长因子、血小板衍生生长因子、IFN等信号向核内转导。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，分别负责转导不同的入核信号。JAK3主要存在于造血细胞中，在淋巴细胞发育中起重要作用。在结构上，JAK3包含SH1～SH7 7个结构域，其中SH1为假激酶域，与激酶域结构类似但无激酶功能，是最常见的突变部位。

新加坡的一项研究首次证实了NKTCL存在JAK3基因突变，并引起JAK/STAT通路的持续激活[50]。在该研究中，35.4%（23/65）的NKTCL患者肿瘤组织检测到JAK3基因突变（JAK3A572V和JAK3A573V）；体外研究进一步证实，JAK3基因突变可导致JAK/STAT信号通路持续激活，且该效应不依赖于白细胞介素-2等细胞因子的存在，最终导致细胞失控性增殖。后续许多研究发现，在NKTCL中也存在JAK3（JAK3V722L、JAK3Y652D等）、STAT3、STAT5B突变引起的JAK/STAT通路异常激活，可能也是NKTCL重要的致病机制[17，50-52]。

JAK3磷酸化可能是独立于JAK3基因突变的引起JAK3/STAT通路激活的另一种重要机制。国内的一项研究采用外显子测序技术对19例NKTCL石蜡标本进行分析，4例检出JAK3基因突变，其中3例为同义突变，1例为无义突变，而30.8%的患者存在JAK3蛋白磷酸化[53]。法国的一项研究中，87%的NKTCL患者存在JAK3蛋白磷酸化，而JAK3突变比例小于20%[54]。上述两项研究提示，相较于JAK3基因突变，JAK3蛋白磷酸化可能是NKTCL更常见、更直接的致病机制。

目前针对JAK3/STAT通路的抑制剂被广泛用于肿瘤及自身免疫性疾病的临床前及临床研究，其中JAK抑制剂——tofacitinib已经被美国FDA批准用于类风湿关节炎的治疗、ruxolitinib用于骨髓增殖性肿瘤的治疗[16]。tofacitinib是一种口服、选择性JAK3抑制剂，体内及体外试验证实可抑制JAK3/STAT通路异常激活，抑制NKTCL肿瘤细胞增殖[55]。此外，研究发现EBV阳性的NKTCL中普遍存在JAK3/STAT5通路异常激活，而tofacitinib可使细胞周期停滞在G1期，减少EBV感染NK细胞LMP1和EBNA1的表达[28]。PRN371是针对JAK3的高选择性抑制剂，对JAK3的亲和力是JAK1/JAK2/TYK2的结合能力的282～1194倍。PRN371可明显抑制JAK3/STAT通路异常激活相关的NKTCL细胞系增殖，抑制集落形成、诱导肿瘤细胞凋亡[17]。目前针对NKTCL的JAK3/STAT通路的靶向药物研究均处于临床前试验阶段，因此需要进一步扩大样本的临床试验证实相关治疗的作用及安全性。

2.5 TP53基因

TP53是研究最广泛的抑癌基因之一[56]。TP53基因编码的肿瘤抑制蛋白p53可以应对多种刺激，调节靶基因的表达，进而诱导细胞周期阻滞、衰老、DNA修复、凋亡等。该基因的突变与多种人类肿瘤及不良预后相关。

TP53基因突变或缺失是皮肤T细胞淋巴瘤蕈样霉菌病/sezary综合征（MF/SS）最常见的基因异常（83%）[57]。NKTCL中也存在有TP53基因突变，其突变情况具有地域差异：中国58%，日本南部地区50%，日本中部地区22%，韩国20%，墨西哥24%[58]。Takahara等[59]在一项包含32例NKTCL患者的队列研究中检出6例TP53的7-9号外显子突变，其中4例错义突变，2例无义突变；错义突变的患者均有p53高表达。研究发现，TP53错义突变与LMP1表达相关（P=0.038），但与p53表达无关。K-M曲线分析，TP53突变是影响无进展生存及总生存的独立预后因素（P=0.021、0.034），合并突变患者的预后相对较差（5年OS，0vs32%，P=0.021）。

p53表达可能是NKTCL的重要预后因素，但TP53基因改变与p53表达之间的关系目前尚不明确。中国的一项研究显示，33.3%（28/84）的NKTCL存在p53高表达，且p53高表达与肿瘤分期（P=0.016）、IPI评分（P=0.026）密切相关；p53表达情况和IPI评分可作为NKTCL患者的独立预后因子（P=0.002，P=0.016）[60]。日本的一项研究分析了51例NK或T细胞淋巴瘤患者TP53基因突变及表达情况，发现TP53基因改变与表达情况不平行，p53高表达者占37%，突变者只占17.8%[61]。鉴于大多数研究均为小样本研究，TP53基因异常、p53表达与NKTCL预后的相关性仍需进一步扩大样本、长期随访的研究证实。

2.6 BCOR基因

BCOR位于染色体Xp11.4，编码的BCOR蛋白是BCL6的共抑制因子，与生发中心B细胞发育密切相关，已有研究证实特异性I类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶可与该蛋白相互作用[62]。

BCOR基因变异在NKTCL中高度特异，突变率可达 21%～32%[51，62]。Dobashi等[63]对日本 25 例NKTCL的研究发现，BCOR突变（32%）是最常见的体细胞突变。Tanaka等[62]首先证实了BCOR缺失突变与T细胞淋巴瘤的发生相关，在BCOR基因缺失突变的T细胞淋巴瘤细胞系中，MYC等Notch1通路的靶分子上调，影响转录及凋亡。此外，BCOR可能与RING1B、PCGF1、KDM2B、PRC1等相互影响，参与肿瘤的发生进展[62，64-65]。鉴于BCOR变异的高频及模式，目前认为BCOR在NKTCL中作为抑癌基因发挥作用，多种形式的突变最终造成基因失活，参与肿瘤的形成。

2.7 DDX 3 X基因

DDX3X基因位于染色体Xp11.3-11.23，是一种ATP依赖性RNA解旋基因。野生型DDX3X蛋白具有下调核RelB表达和降低细胞ERK磷酸化水平的作用，使细胞增殖受抑，具有抑癌基因产物特征。而DDX3X基因突变导致其编码蛋白功能失活，引起细胞过度增殖。

在NKTCL中存在DDX3X高频突变，在部分研究中其突变率居于各基因突变的首位。Jiang等[14]分析105例NKTCL患者基因的外显子测序结果，发现20%的患者合并DDX3X突变，是最多见的突变。和野生型DDX3X蛋白相比，突变型基因产物的RNA解旋能力弱，激活了NK-κB通路，失去对NK细胞周期进展的抑制作用。研究认为，与IPI类似，TP53和DDX3X是NKTCL患者独立预后因素，突变型患者预后差。该研究根据临床预后指标与基因突变情况将患者进行风险分层：低危组（IPI0～1，TP53/DDX3X野生型），中危组（IPI0～1，TP53/DDX3X突变型；IPI2～5，TP53/DDX3X野生型），高危组（IPI2～5，TP53/DDX3X突变型）。根据该预后模型，3组患者的2年总生存率分别为（95.8±4.1）%、（57.2±8.9）%和（13.4±8.8）%（P＜0.01）；2年无进展生存率分别为（93.5±4.5）%、（50.5±9.3）%和（7.8±7.4）%（P＜0.01）。尽管该研究中位随访时间仅为18个月，但研究结果提示，将基因情况加入到预后分层中可能对未来NKTCL治疗模式的选择具有重要指导意义。

3 小结与展望

随着新技术的发展，基因检测更加普遍，对于不同肿瘤相关基因的研究受到越来越多的关注。目前在NKTCL中基因检测相关研究提示，基因异常改变可能在NKTCL发生、发展及预后评价中均有重要意义。由于该过程涉及基因、RNA、蛋白质、细胞因子等多种组分、庞大的调控网络及机制，需要大量转化研究进行分析、证实；期待越来越多的研究成果转化为临床诊疗手段。