学习记忆障碍动物模型及行为学检测指标的评析

罗燕，陈真

（中国药科大学药学医学基础实验教学中心，江苏南京 211198）

随着社会的进步、人口老龄化的发展、生活方式的改变、环境的恶化以及社会竞争压力的增大，阿尔茨海默病、血管性痴呆、抑郁症等神经性相关疾病的发生概率大大增加，而这些神经性相关疾病都伴随着学习记忆障碍。有资料预测，截止到2050年美国痴呆人口数量将由450万上涨到1.14亿［1］。学习记忆障碍模型和行为学检测方法是新药研发中至关重要的环节。因此构建学习记忆障碍动物模型以及完善行为学检测方法，以期更好的研发出治疗学习记忆障碍药物显得极其重要。针对目前国内实验者在实验模型和检测指标时的选择困惑，笔者在文献检索的基础上，对以下模型和检测指标进行了对比性实验，得出了一些收获与体会，总结如下。

1 学习记忆障碍模型的构建

目前学习记忆障碍的发病机制大致可分为以下5个类别：脑外伤引起记忆受损；脑内的β-淀粉样失衡、胆碱能失衡、蛋白合成异常、基因表达异常导致的学习记忆障碍；脑缺血缺氧导致自由基损伤、钙平衡失调、兴奋性毒性及神经细胞死亡而诱导的学习记忆障碍；衰老导致神经细胞的自然老化引起学习记忆功能衰退；精神、心理异常导致的皮层萎缩促使学习记忆障碍发生。构建学习记忆障碍模型主要从记忆的3个阶段入手，即破坏记忆的获取、巩固、再现。目前国内外常用的学习记忆障碍动物模型的构建方法如下。

1.1 东莨菪碱诱导的记忆获得障碍 东莨菪碱是一种非选择性M胆碱能受体抑制剂，它能够阻断胆碱能信号通路，抑制乙酰胆碱传递从而减弱海马的长时增效［2］。此模型主要用于筛选作用于胆碱能受体的药物，由于东莨菪碱对动物的损伤是可逆的，只能部分模拟阿尔茨海默病的病症，这就限制了该模型的发展。训练前腹腔注射3 mg·kg－1的东莨菪碱，给药10 min后对雌雄小鼠皆可造成记忆获得障碍［3］。

1.2 亚硝酸钠诱导的记忆巩固障碍 亚硝酸钠是一种脑缺氧剂，进入机体后会造成机体产生高铁血红蛋白血症。高铁血红蛋白与羟基结合会造成其不能与氧结合，从而导致脑缺氧，进而引起脑内一些神经递质，如 γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）、乙酰胆碱的浓度失衡，以及神经元的可塑性改变和坏死［4］。训练后立即单次腹腔注射亚硝酸钠120 mg·kg－1即可构建小鼠记忆巩固障碍模型［5］。

1.3 乙醇诱导的记忆再现障碍 乙醇是一种中枢性抑制剂，会导致中枢神经系统中的细胞产生毒性反应［6］。乙醇可通过影响注意力、自控功能、情绪等来诱发学习记忆障碍［7］。乙醇可使脂质过氧化、活性氧大量累积促使氧化应激最终损害胆碱能神经系统［8］。在测试前30 min灌胃低浓度的乙醇即可明显破坏记忆过程，造成学习记忆再现障碍［9］。

1.4 D-半乳糖诱导的记忆再现障碍 D-半乳糖亚急性衰老模型是在一定时间内连续皮下注射大剂量D-半乳糖，引起糖代谢紊乱导致脑细胞受损。高剂量的D-半乳糖一方面在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖和过氧化氢，促使超氧阴离子和氧自由基大量产生，大量的自由基使脂质过氧化物形成，导致细胞功能障碍，使细胞代谢功能下降，从而发生一系列与老化相似的病理变化［10-11］；另一方面在游离氨基的协作下使蛋白和多肽的结构改变，通过非酶糖化作用促使晚期糖基化终末产物（AGEs）累积，最终导致脑内氧化损伤［12］。4周内每天给予120 mg·kg－1D-半乳糖即可构建学习记忆障碍模型［13］。

1.5 β淀粉样蛋白（Aβ）沉积诱导的记忆障碍Aβ是由Aβ前体蛋白（APP）水解而来的多肽，能够抑制乙酰胆碱转移酶的活性进而导致胆碱能神经失衡［14］。脑内过量的Aβ沉积会促使神经元细胞变性、炎性反应发生、氧化应激、tau蛋白高度磷酸化形成神经元纤维缠结，最终导致细胞死亡［15］。Aβ沉积同时会影响钾离子通道、NMDA受体、电压门控性钙通道等离子通道的开放，最终促使钙平衡失调引发学习记忆障碍［16］。在鼠的第三脑室注射Aβ后，Aβ在脑区域内累积造成学习记忆障碍，这种学习记忆损伤方式与阿尔兹海默病的形成方式高度类似［17］。

2 学习记忆障碍模型的行为学检测方法及评析

行为学检测是基于条件反射的一种实验方法，目前国内应用较为广泛的是以被动逃避条件反射为基础的跳台法、Y迷宫法、避暗法以及Morris水迷宫法。

2.1 跳台法 装置大小为10 cm×10 cm×60 cm，平均分成5间，底面是可以通36 V连续电刺激的铜栅，每个反应箱内右后角置一高度和直径均为4.5 cm的平台。

训练时将小鼠于测试箱内适应环境3 min后，确定小鼠均位于铜栅后，立即通电，受电击后，小鼠跳到安全平台躲避电击。记录小鼠第一次跳上跳台的反应时间（学习潜伏期）和5 min内受到的电击次数（学习错误次数），这两项为学习成绩。测试时，小鼠放于跳台上，记录小鼠第一次跳下跳台的时间（记忆潜伏期）和5 min内错误次数，5 min内未跳下跳台的小鼠其潜伏期按300 s计算，这两项为记忆成绩［18］。

跳台法优缺点：装置简单易操作，灵敏度高，能同时操作5只动物，较好地进行组间平行实验。缺点是当动物站立在同一根刺激电极时，足底逃避电击，出现误差；电刺激对动物损伤大；动物个体差异大，需加大样本量或进行预实验筛选。

2.2 Y迷宫法 由3条等长的臂和其交界区组成，底面有等距的电栅，内侧壁贴有导电的铜片，各臂末端均装有刺激信号灯。控制面板由电压显示区、电压调节旋钮和“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0”4个按键组成。按下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ键时，所对应臂的刺激信号灯亮，此时该臂为安全区，不亮灯的两臂及交界区在2 s后均通电成为非安全区。按下0键，只有交界区通电。

训练时将小鼠放入未通电的迷宫中适应5 min，再将小鼠放入任意一个臂，另外两支臂中一支以灯光信号表示安全区。灯亮后延时2 s自动接通40 V电流，小鼠跑至安全区时让其停留30 s，巩固记忆。训练10次，记录10次里的正确次数记为学习成绩。24 h后记忆测试，小鼠直接跑至安全区为正确反应，记录连续10次训练中的正确次数和记忆潜伏期（第1次跑对所需时间）［19］。

Y迷宫法优缺点：构造简单、操作便捷、准确性较高。缺点是一次试验只能观察1只动物，下一只动物实验时需对仪器进行擦拭晾干确保无上一只动物气味，耗时长，较难实现组间的完全平行。

2.3 避暗法 40 cm×12 cm×12 cm的条件反射箱是由明室和暗室及两室之间3 cm直径的洞口组成，箱底有等距的铜栅，暗室的铜栅可通入36 V电流。

训练时将小鼠头背着洞口放入明室，适应环境3 min后通电，通电持续5 min，小鼠进入暗室就会遭受电击，其正确反应是回到明室。24 h后测试，小鼠第1次进入暗室的时间记为潜伏期，5 min内进入暗室的次数为错误次数，5 min内未进入暗室的潜伏期按 300 s计算［20］。

避暗法优缺点：操作简单易行、对记忆再现实验有较高的灵敏度。缺点是影响因素多，耗时长。

2.4 Morris水迷宫法 直径120 cm、高50 cm的圆形水池，四周有用于辨别方向的标志。水池分为4个象限，直径为9 cm的可移动平台置于第2象限，且位置固定，平台位于水下0.5 cm处。水池上方安装有视频采集分析系统，可以自动记录分析动物游泳轨迹。

（1）定位航行实验：历时4 d，第1～2天平台可见（平台上方插有高5 cm的黑色旗子用于动物辨认），第3～4天平台不可见（撤掉旗子）。每天的同一时间，小鼠依次从第一象限开始，面朝池壁放入水中，记录从入水到上台的时间，即为逃避潜伏期。若小鼠90 s内没有找到平台，则实验自动结束，此时记录逃避潜伏期为90 s，并引导小鼠置于平台30 s。休息10 min后换入水点，依次训练4个象限。

（2）空间探索实验：训练4 d，第5天撤去平台开始实验，历时1 d。小鼠从距离原平台最远的象限开始，面朝池壁放入水中，记录入水后90 s自由航行的轨迹，统计小鼠穿越原平台所在位置次数，目标象限（原平台所在象限）的停留时间百分比以及穿越目标象限的次数［21］。

水迷宫法优缺点：优点是原理简单易懂，构造简单、检测灵敏，对实验动物损伤小，不易受气味影响，实验数据较丰富能更好地完整地体现出学习记忆差异。缺点是对实验条件要求较高，水温、平台高度、声音、实验时间、入水的朝向、高度都应该尽量一致；单次定位航行训练时间的设定有较大的经验性，个体差异较大。

3 小结与展望

迄今为止，猴、啮齿类动物、蠕虫和果蝇等均可以用来构建学习记忆障碍模型，即使小鼠在表观上并不能表现出斑块沉积，但一些特殊的造模方法仍然能使小鼠脑内特定区域形成斑块沉积和神经元缠结，同时小鼠在实验可行性及经济方面的优势促使小鼠成为最常用的学习记忆障碍模型。除了文中提及的国内常用的东莨菪碱、亚硝酸钠、乙醇、D-半乳糖、β淀粉样沉积、脑缺血诱导的学习记忆障碍模型外，还可以用一些其他神经毒性物质来构建学习记忆障碍模型，如：6-羟基多巴胺、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢嘧啶（MPTP）、重金属等毒性物质［22］。然而这些模型只是构建了一种疾病状态并没有模拟疾病的发生发展过程，因此研究者通过构建转基因小鼠来构建自发的学习记忆障碍模型，例如APP／PS1转基因小鼠与AD患者脑内均出现神经网络活动异常兴奋及海马代偿性产生的抑制［23］，这就表明APP／PS1转基因小鼠与AD患者具有高度相似的神经活动，为后面的机制研究和药物研发奠定了坚实的基础，然而实验条件及高昂的花费限制了这一模型的广泛应用。

构建好学习记忆障碍模型后，并不能直观的从动物的表型上判断出来，只能通过条件反射来区别。文中提及的跳台法、避暗法、Y迷宫法都是基于被动逃避条件反射为基础的实验方法，它们具有操作简便、指标明确、易于观察等优点，然而在这些实验过程中有较多的主客观因素会对其造成影响，这就导致重复性差，而且即使模型成功、药效良好，它们的组间差异也较小。这就要求在实验过程中，应尽量保证外界环境及实验人员的稳定，目前行为学检测方法仍需进一步的完善。

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