温阳法对肝癌免疫微环境的影响

蔡之幸，陈 越

(上海交通大学附属同仁医院中医科，上海 200336)

原发性肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，病死率高居世界肿瘤病死率的第3位[1]。其中肝细胞肝癌是最常见的原发性肝癌。目前认为，肝细胞肝癌并不是单纯由肝癌细胞构成，还包括多种彼此相互作用的细胞以及细胞外基质所形成的存在复杂交汇网络的肝癌微环境。肝癌微环境可从多方面决定肝癌的表型[2]。研究肝细胞肝癌的微环境，可能有助于预测肝细胞肝癌细胞的特定表型，这对找到新的抗癌策略至关重要。

肝癌常归属于中医学“胁痛”“鼓胀”“黄疸”“水肿”“积聚”等范畴[3]。早在《黄帝内经》中就提出了肿瘤形成与阳气不足、阴寒凝滞的关系。《灵枢·百病始生》云：“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣。……温气不行，凝血蕴里而不散，津液涩渗，著而不去，而积皆成矣。”指出肿瘤形成的根本原因在于阳气不足、寒湿过盛[4]。《素问·阴阳应象大论》有“阳化气，阴成形”的理论。而肿瘤的发生是有形蓄积的过程，即“阴成形”的过程，其原因为“阳化气”的功能失调[5]。笔者将着重探讨温阳法对肝癌免疫微环境的调节作用。

1 与肝癌有关的免疫微环境

对肝癌的研究离不开肝癌所处的免疫微环境，因为肝脏本身就是一个特殊的免疫器官。肝脏中存在有免疫相关细胞，包括抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)、髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)、淋巴细胞等，肝中APC包括肝窦状内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)、肝巨噬细胞、肝树突状细胞等。肝脏中APC吞噬清除抗原后，会限制适应性免疫的活化，抑制效应细胞的分化成熟，同时促进调节性细胞亚群的增殖[6]。

1.1 相关免疫细胞 LSECs是一群包围在肝细胞周围的高度特化的内皮细胞。在抗原性物质处于较低水平时，LESCs会与CD8+T细胞相互作用，从而降低肝细胞表面的共刺激因子B7-1和B7-2的表达，同时升高共抑制因子程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1, PD-L1)/PD-L2的表达[7]。LESCs还能诱导CD4+T细胞分化成免疫抑制性的细胞[8]。肝巨噬细胞是全身单核-吞噬细胞系统重要的组成部分，生理条件下肝巨噬细胞能通过抑制效应T细胞增殖活化，促进调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)分化来抑制免疫活化[9]。而处于炎性状态下，肝巨噬细胞介导的免疫抑制状态将被打破。肿瘤浸润性树突细胞一方面可诱发特异性抗肿瘤免疫，另一方面也能诱导Treg的产生，其过程与PD-L1有关[10-11]。肝癌微环境中一个关键组成部分为MDSCs，它代表未成熟骨髓细胞的异质群体，在分化的不同阶段停滞，并响应各种肿瘤因子而扩增肝中MDSCs，具有显著抑制免疫应答的能力[12]。MDSCs可由肿瘤微环境中细胞因子诱导产生，如白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-10、血管内皮生长因子。其主要通过对T细胞、自然杀伤细胞的抑制，以及对Treg的激活，诱发机体的“免疫逃逸”[13]。

1.2 相关免疫因子 IL-10是重要的免疫抑制因子，其与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)共同激活B7-H1的表达，使肿瘤发生免疫逃逸[14]。IL-17是一种主要由CD4+T淋巴细胞、自然杀伤细胞等分泌的前炎性细胞因子[15]。CD4+T淋巴细胞可分成Th1、Th2、Treg和Th17四大亚群，其中Th17能分泌IL-17A、IL-17F等细胞因子。炎性因子IL-17在MDSCs形成的免疫耐受过程中起到重要作用，近年来不断受到研究者的重视。IL-17受体缺失抑制了MDSCs的浸润，促进CD8+T细胞的浸润，MDSCs来源的IL-17因子又能驱化Treg到达肿瘤部位，增强其免疫抑制功能。MDSCs诱发的免疫逃逸主要集中在MDSCs对T细胞、自然杀伤细胞的抑制，以及对Treg的激活，与其联合抑制机体的免疫反应[13]。研究发现，IL-17介导肿瘤的生长和转移主要通过激活JAK2/STAT3信号通路而发挥作用[16]，调控肝癌细胞p53表达进而下调化学治疗诱导的凋亡敏感性[15]。作为肿瘤免疫逃逸的主要调控因子[17]，转化生长因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)可抑制多种免疫细胞在肿瘤组织中增殖分化，表现为诱导肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TAN)极化，阻断树突状细胞的成熟，促进Treg的产生，还可以募集MDSCs，加强TGF-β信号在肿瘤微环境中的促癌作用。因此，抑制TGF-β的功能，重建抗肿瘤免疫环境将成为治疗肿瘤的一个重要策略。

Treg通过产生TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子而抑制T细胞功能[18-21]；通过表达负调控因子如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、免疫球蛋白-3及PD-1而抑制效应T细胞产生；去除Treg可增强效应T细胞的功能，增强抗肿瘤免疫治疗的疗效。另有研究发现， Th17/Treg型细胞为新型CD4+T细胞亚群，起重要的免疫调控作用[22]。

1.3 主要信号通路 肝癌的发生发展转移是一个长期的、多因素作用的结果。目前实验研究涉及的主要通路有Ras/Raf/Mek/Erk信号通路[23]、Hedgehog信号通路[24]、EGFR信号通路[25]、p38MAPK信号通路[26]、PI3K/AKt信号通路[27]、TGF-β信号通路[17]、Wnt信号转导通路[28]、STAT3信号通路[29]等。其中STAT3被证实处于多条癌症信号通路的交汇点， JAK-STAT、PI3K-mTOR、Ras-Raf-MAPK等信号通路均涉及STAT3信号传导[30]，对STAT3信号通路的研究成为目前研究的热点之一。

2 温阳法影响肝癌免疫微环境的中医理论基础

关于肿瘤的形成，《灵枢·水胀》云：“寒气客于肠外，与卫气相搏，气不得荣，因有所系，癖而内著，恶气乃起，息肉乃成。”《难经·五十五难》曰：“积者，阴气也，其始发有常处，其痛不离其部。”《诸病源候论·虚劳病诸疾》曰：“积聚者，由寒气在内所生也，血气虚弱，风邪搏于脏腑，寒多则气涩，气涩则生积聚也”“积者，脏病也，阴气所生也”“瘕病者，皆由久寒积冷，饮食不消所致也，……虚劳之人，脾胃气弱，不能克消水谷，复为寒冷所乘，故结成此病也”。《临证指南医案》曰：“著而不移，是为阴邪聚。”可见，中医理论多认为肿瘤为有形之物，属阴邪范畴。

《外科医案汇编》记载：“正虚则为岩。”基于肿瘤微环境的扶正祛邪治则，体现了中医肿瘤治疗的整体观和辨证论治原则[31]。然而，初治虽不乏疗效，久治则克伐中气，癥积难消[32]。实际上，肝癌术后气血俱虚，经历长时期化学“驱邪”治疗，癌瘤生长虽暂时得以控制，但仍然存在，可谓“正虚邪不盛”，然而，正气亏虚，阳气衰弱，不能推动气血运行，日久则使病邪留滞，气机不畅，血运瘀阻，积瘤复大。肝癌阳虚证，主要表现为四肢畏寒、神疲乏力、喜静喜卧、腹满鼓胀等。研究表明，肝癌患者体质以气虚质和阳虚质为主，阳虚证贯穿于肝癌TMN分期及Okuda分期始终，随着肝癌的进展，“阳虚”的分布比例越来越高[33]。早在《医宗必读》中，李中梓就提出“积之成也，而后邪气据之”，治疗上主张“气血俱要，补气在补血之先，阴阳并需，而养阳在养阴之上”。中医温阳法益气温阳，扶阳抑阴，首先顾护阳气这一人之根本，益火之源以消阴翳，消积除癥。

3 温阳法调节肝癌微环境的临床及实验研究

多位学者开展了肝癌阳虚证特征及温阳法论治肝癌的临床研究。温通助阳、益气升阳法、益气温阳解毒法在临床肿瘤防治中具有显著疗效[34-36]。陈群伟等[37]探讨了原发性肝癌阳虚证患者血清代谢组特征性改变，发现肝癌阳虚证患者存在脂质代谢、氨基酸代谢的紊乱以及糖类等代谢物浓度的下降。孙慧茹等[38]发现，温阳散结解毒汤(西洋参、黄芪、鹿角胶、附子、草乌等)可有效抑制肿瘤细胞的生长和转移，与化学治疗联用，不仅疗效明显，且可保护免疫器官，提高细胞免疫功能，以及对抗化学治疗引起的骨髓抑制。基于中医学温阳固肾、益气升阳、扶正驱邪理论，研究发现温阳益气类中药(黄芪、熟地黄、肉苁蓉)可提高肿瘤微环境中骨髓间充质肝细胞稳定性[39]。

将蛋白组学技术及基因组学技术应用于温阳法对肝癌微环境影响的研究已成为一大热点。实践证明，许多温阳散寒方药可逆转肿瘤细胞的生物学行为，如抑制其增殖，诱导其凋亡、分化，抑制肿瘤微血管形成[40]。温阳法[41]对肝癌具有免疫保护作用。研究显示，四逆汤能调节机体特异性免疫和固有免疫[42]，通过上调肝癌组织p53蛋白的表达诱导肝癌细胞凋亡[43]，结果提示温阳法有激发机体免疫功能的作用。四逆汤能通过下调微环境中细胞的CD4+CD25Foxp3比例，上调微环境中Th型细胞因子IL-6、IL-10水平，从而改善肝癌微环境免疫抑制状态[42]。四逆汤可能通过下调肿瘤组织中TLR4蛋白的表达，改善肝癌微环境免疫抑制状态[44]。黄芪四君子汤可增强肝癌荷瘤小鼠整体及肿瘤微环境中特异性抗肿瘤免疫，能增加肝癌荷瘤小鼠整体及肿瘤微环境的免疫监视功能和固有免疫功能，改善免疫抑制状态，两者呈量效关系[45]。中药复方制剂温化胶囊(主要由附子、贝母等组成)通过温阳散寒与化痰活血，发挥温阳化气散结的作用。实验研究表明，温化胶囊具有诱导Bel-7402人肝癌细胞株凋亡的作用，并引起细胞周期的改变[40]。益气温阳补肾药(附子、肉桂、淫羊藿)与益气养阴药北沙参、麦冬等配伍后的药物血清能抑制SMMC-7721人肝癌细胞癌基因N-ras的表达，促进抑癌基因p53的表达[46]。以温阳法为主的中药复方治疗联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)，能够抑制EGFR-TKI耐药，提高EGFR-TKI的疗效，其作用机制可能与调控相关miRNA基因及雌激素受体表达，对抗肿瘤异质性，调节肿瘤微环境等因素有关[41]。

4 结语

原发性肝细胞肝癌的发生、进展及复发与其免疫微环境密切相关[47-48]。中药及其有效成分正被越来越多地应用于调节肝细胞肝癌的免疫微环境。温阳类中药能对肝癌免疫耐受及免疫逃逸现象进行干预，这既有中医理论的支撑，又有确切的临床疗效。但目前这方面的临床及实验研究较少，对温阳法调节肝癌免疫微环境的分子机制及信号通路仍不明确，仍有待深入研究。

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