非小细胞肺癌患者ALK表达与临床病理特征对比分析

王 弦 李晓灿 江冬瑞 叶飞飞 吴 强

近年来，随着肿瘤学和分子生物学技术的快速发展及对肺癌的发生发展、转移分子机制方面的深入研究，以分子靶向诊疗为核心的“精准医疗”概念被人们所提出并应用到临床中，给肺癌的治疗带来了新的契机[1]。克唑替尼是针对EML4-间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)新的治疗靶点，全球每年新发肺癌ALK突变阳性患者约有6.8万人，这些患者均可从靶向治疗药物克唑替尼中获益[2-3]。因此，开展针对EML4-ALK融合基因的检测具有重要的临床意义。基于此，为研究肺癌患者EML4-ALK融合基因的阳性率，提高肺癌诊治水平，本研究选取100例NSCLC患者为研究对象，采用CSCO肿瘤生物标志物专家委员会专家组所推荐的全自动免疫组化的方法检测ALK的表达，并与患者的临床病理特征进行统计分析，以期为相关疾病的诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 抗ALK兔单克隆抗体(D5F3)、阴性质控抗体、OptiView DAB免疫组化检测系统和增强试剂盒[罗氏诊断产品(上海)有限公司]；Ventana Bench Mark XT全自动免疫组化仪[罗氏诊断产品(上海)有限公司]；正电荷黏附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)。

1.2 研究对象 选取安徽医科大学第二附属医院2016年1月至2017年10月收治的经病理诊断确诊为非小细胞肺癌的100例患者作为研究对象，所有患者诊断标准均依照WHO(2015年)肺肿瘤分类。患者年龄42～82岁，平均 (62.50±8.00)岁；男性59例，女性41例；48例有吸烟史，52例无吸烟史；肿瘤直径≤5 cm的77例，肿瘤>5 cm的23例；左肺肿瘤42例，右肺肿瘤58例；腺癌84例，非腺癌16例；有淋巴结转移42例，无淋巴结转移58例。采集基本临床特征资料：年龄、性别、吸烟史、肿块直径、发生部位、病理分型和淋巴结转移等。所有数据采集均征得患者同意并签署知情同意书。

1.3 方法 所有标本均采用10%中性缓冲福尔马林溶液固定，制作石蜡标本后进行组织切片，切片厚度为4 μm，分成阴性质控片组和检测片组。其中，在检测片组捞取1个正常阑尾切片作为阳性对照组。按照罗氏公司ALK蛋白检测说明流程上机检测。

1.4 判读标准 采用二元判读法，根据是否存在二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)信号，每位患者均同时判读ALK抗体检测片和相应的阴性质控片。阴性质控片评估非特异的背景染色和已知会因特定组织成分而染色的背景染色强度；ALK(D5F3)抗体检测片上正常阑尾的神经节细胞DAB显色作为阳性对照，帮助判断此张切片染色是否成功；待检组织肿瘤细胞标准为：阳性为肿瘤细胞中存在很强的颗粒状胞浆染色(任何百分比的阳性肿瘤细胞)；阴性为肿瘤细胞内不存在强颗粒状胞浆染色。其中，诊断为阳性时需排除已知的染色元素，包括：肺泡巨噬细胞中较淡的胞浆点彩；神经来源的细胞(神经细胞和神经节细胞)；腺状上皮染色，以及淋巴细胞性浸润中的细胞。另外，NSCLC患者正常黏膜(包括黏蛋白)内以及坏死组织区域内可见一些背景染色也应从临床评估中排除。

1.5 统计学方法 应用SPSS 21.0进行统计分析，计数资料以率表示，率的比较采用χ2检验或校正χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALK在NSCLC患者中的表达 ALK阳性可见很强的颗粒状棕黄色胞浆染色，主要表达定位于肺癌组织的细胞质；ALK阴性未见任何颗粒性棕黄色阳性信号；阳性对照组神经节细胞呈阳性，见图1。100例NSCLC患者中，有6例ALK阳性，阳性表达率为6.00%。

2.2 不同临床病理特征NSCLC患者ALK表达比较 不同年龄区间患者的ALK阳性表达率进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同肿块直径间患者的ALK阳性表达率进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同病理分型间患者的ALK阳性表达率进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)。而不同性别、是否吸烟、发生部位以及是否淋巴结转移间患者的ALK阳性表达率进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨论

肺癌是当今世界危害人类健康最大的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率近年呈逐年升高的态势，其病死率已跃居首位，且5年生存率较低[4-5]。我国是肺癌的高发国家之一，发病率及病死率都高于世界平均水平。NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌和类癌等。传统的一线化疗药物铂类在肺癌的治疗中一直处于主导地位，但由于传统的化疗药物缺乏组织特异性，且长期用药对患者身体带来非常大的副作用，是肺癌治疗方面多年来所面临的难题之一[6-7]。

ALK是一种由人类ALK基因编码的酶，又被称为酪氨酸激酶受体或CD246，是胰岛素受体超家族成员之一[8]。ALK在大脑的发育过程中扮演着重要的角色，由于其编码的酪氨酸激酶只在一定的神经元细胞中表达，因此只对神经系统中的特定神经元产生影响。作为一种新的受体酪氨酸激酶，ALK基因在细胞生理活动中发挥重要的调控作用，其异常表达时常通过扩增、突变和形成融合基因等方式产生强致癌驱动基因，从而导致肺癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤等肿瘤的产生[9]。1994年，Morris等[8]发现ALK以NPM-ALK融合蛋白的形式存在于间变性大细胞淋巴瘤；2007年，Soda等[10]发现EML4与ALK基因在约6.7%的NSCLC患者中发生融合突变。EML4-ALK融合基因由第2号染色体插入形成，其编码的蛋白产物可导致ALK酪氨酸激酶持续高表达，从而激活下游的PI3K-AKT、MAPK及JAK-STAT等信号传导通路，导致肿瘤的发生和转移，在NSCLC中发挥重要的驱动作用，被认为是NSCLC新兴的生物标记物和治疗靶标，对肺癌的临床诊疗具有十分重要的生物学意义。

克唑替尼作为ALK融合基因的小分子靶向药物，在临床治疗中显示出强大的抗肿瘤活性。因此，准确地检测ALK并研究总结其临床病理特征显得尤为重要。Wang等[11]研究发现，4981例NSCLC患者中有405例ALK表达阳性，其预后明显好于ALK阴性患者，且患者的吸烟状况也影响ALK基因相关的NSCLC患者的预后。Inamura等[12]发现EML4-ALK融合基因主要存在于轻度吸烟者(每年少于10包)或不吸烟的的腺癌患者中，并且与表皮生长因子受体或鼠类肉瘤病毒癌基因突变无关。Dai等[13]研究表明对ALK阳性的NSCLC患者使用ALK抑制剂可能会增加放疗的局部控制效果，针对晚期的NSCLC患者在放疗之前进行ALK检测，继而通过联合ALK抑制剂和放疗，从而为临床提供一种毒性较低的治疗方案。

本研究采用全自动免疫组化法检测了100例NSCLC患者的ALK蛋白的表达情况，结果显示ALK主要表达定位于肺癌的细胞质中，且NSCLC患者的ALK阳性表达率为6.00%，与黄晓琳等[14]研究(3%～8%)数据一致。分析发现，ALK阳性患者41～60岁人群的占比较高；女性和不吸烟者占优势，但差异无统计学意义(P>0.05)。ALK阳性患者组织学类型以腺癌为主，且肿瘤直径以≤5 cm居多，但肿瘤的发病部位没有显著特征；另外，淋巴结转移率高于ALK阴性患者，但差异无统计学意义。根据国内相关研究[14-16]，ALK阳性患者以年轻、女性、不吸烟及腺癌为主要特征，本研究显示出同样的结果。然而本研究将不同性别、吸烟史、发生部位以及是否淋巴结转移间患者ALK阳性表达率进行相比，差异无统计学意义(P>0.05)，这可能由于本研究的病例数较少，从而导致阳性样本偏少引起的偏差。另外，本研究发现肿瘤直径可能成为ALK阳性患者的潜在特征，下一步研究中将扩大样本量进一步证实，有望为NSCLC的临床诊疗提供新的理论依据和参考。