一株鸭坦布苏病毒的分离与鉴定

范振涛

鸭坦布苏病毒病（ducktembusu virus disease，DTMUVD）是由鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus，DTMUV）感染引起的一种以产蛋率和采食量急剧下降为主要特征，以出血性脑膜炎、卵巢炎为主要病理变化的传染病，该病发病率高，传播迅速。该病主要引起蛋鸭及种鸭发病，导致蛋鸭采食量减少、产蛋率急剧降低甚至停产。本病除感染蛋鸭及种鸭外，还可引起多品种肉鸭发病，给中国养鸭业带来巨大经济损失。本研究通过对发病鸭场鸭进行病理剖检、病毒分离与鉴定，成功分离到1株鸭坦布苏病毒，进而确定该鸭场的致病原为鸭坦布苏病毒，为鸭坦布苏病毒病的流行病学、毒株的致病性研究、疫苗与诊断试剂盒的研制提供了参考。

1材料和方法

1.1临床症状与病理剖检观察

山东省博兴县某蛋鸭场，产蛋鸭采食量突然大幅下降，产蛋率急剧降低甚至停产。发病鸭体温升高，排绿色稀粪，后期出现神经症状，表现为瘫痪、翻滚、站立不稳及共济失调等。对发病鸭进行病理解剖，可见卵巢出血、萎缩和破裂，肝脏肿大、淤血，脾脏肿大。临床初步诊断为鸭坦布苏病毒病，送实验室进行病毒分离和鉴定。

1.2病料采集與处理

无菌采集病死鸭的卵巢、脾脏、肝脏等病变组织，将组织病料与灭菌生理盐水以1：3比例研磨成组织匀浆，-20℃反复冻融3次，12000r/min离心15min，吸取上清液备用。

1.3病毒分离

将离心后的上清液用0.45μm滤膜过滤，之后通过尿囊腔途径接种10日龄鸭胚10枚，按照0.1mL/胚接种。同时取5枚10日龄鸭胚接种灭菌生理盐水作为对照组。弃去24h内死亡的鸭胚，每天照蛋观察鸭胚的死亡情况，对死亡鸭胚剖检，观察病理变化，收集死亡鸭胚的尿囊液。

1.4血凝性测定

采集鸡的红细胞，制备1%鸡红细胞悬液，鉴定收集的含病毒鸭胚尿囊液有无血凝性。

1.5 RT-PCR鉴定

设计鸭坦布苏病毒的1对特异性检测引物，上游引物P1：5-GGCTT GTTTGGAAAAGG-3，下游引物P2：5-TTCCA GAGTACTTCACTG-3，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用病毒基因组提取试剂盒提取冻融后的组织病料及收获的DTMUV鸭胚病毒液各200μL，利用一步法RT-PCR反应试剂进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应程序如下：50℃50min；94℃5min；94℃30s，52℃45s，72℃60s，30个循环；72℃10min，4℃终止反应。取10μL RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6核酸序列鉴定

将RT-PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行核酸序列测定，将测得的序列与GenBank中登录的序列进行比对分析。

2结果与分析

2.1病毒分离结果

接种鸭胚死亡时间均在96-120h，死亡鸭胚体表面具有出血点，肝脏肿大、出血严重，心脏出血。无菌条件下收获死亡鸭胚的尿囊液，-20℃冷冻保存。

2.2血凝性测定结果

收集的尿囊液对1%鸡红细胞无凝集性。

2.3 RT-PCR与核酸序列鉴定结果

组织病料和鸭胚病毒液的PCR扩增产物均具有大小为514bp的特异性条带，与预期大小相符。将RT-PCR扩增产物的测序结果与GenBank中登记的鸭坦布苏病毒核酸序列进行比对，同源性高达99%以上，表明扩增片段是鸭坦布苏病毒的特异性序列，说明发病鸭场的致病原为鸭坦布苏病毒。

3讨论

鸭坦布苏病毒属黄病毒科黄病毒属，该属病毒大部分为虫媒传播病毒，是一种有囊膜的病毒，对乙醚和氯仿较为敏感。主要侵害鸭的生殖系统，导致种蛋鸭的采食量和产蛋量急剧下降。病毒进入机体后，主要侵害血管内皮细胞，形成病毒血症后，脾脏、生殖器和脑组织受侵，在脾脏、卯泡膜和脑等组织中都可检出病毒，在病鸭的咽喉和粪便中也含有病毒。该病自2010年以来开始在我国部分地区暴发和流行，对鸭坦布苏病毒病的研究也引起了动物防疫部门及研究学者的日益关注。病毒分离是疾病诊断最常用的方法，此外还可以采用多种实验室快速诊断方法，从而提高对疾病的诊断效率及准确性，因此采用RT-PCR方法对本病进行诊断，对早期临床治疗和疫情的控制显得十分必要。本研究通过发病鸭的临床症状及剖检病理变化初步诊断为鸭坦布苏病毒感染，通过实验室PCR检测，最终确定疫情为鸭坦布苏病毒感染，在此基础上通过鸭胚分离到1株病毒，并通过PCR和序列鉴定分离毒株为鸭坦布苏病毒。该病目前尚无有效药物进行治疗，疫苗免疫接种对本病的防控具有重要意义，目前商品化的疫苗有WF100株弱毒疫苗和HB株灭活疫苗。除疫苗免疫外，鸭坦布苏病毒病的防控还要加强饲养管理，改善环境，建立全面的卫生消毒制度，对鸭场定期消毒，消灭鸭场中的蚊蝇，防止蚊蝇传播疾病，加强对用具设备和种蛋的消毒及病死鸭的焚烧和无害化处理，对病鸭要及时隔离、治疗。本研究中鸭坦布苏病毒的成功分离与鉴定，为发病鸭场找到了致病原，丰富了流行病学资料和毒株资源，为鸭坦布苏病毒的进一步研究及相关疫苗及诊断试剂的研制提供了研究资料。