前处理工序对固态发酵仔猪配合饲料的影响

■管军军 张天勇 陈小鸽 王志祥

（1.河南农业大学畜牧学博士后科研流动站，河南郑州450002；2.河南广安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南郑州450001；3.河南省畜产品质量监测检验中心，河南郑州450001）

仔猪因先天免疫力缺乏，消化系统不健全等生理特性，市面上出现了很多针对仔猪的饲料，但在使用上经常会出现了一些实际问题，如采食量降低、生长停滞、腹泻增加等情况。为了解决上述问题，可将仔猪料中主要原料豆粕与玉米进行发酵，可以降解或部分降解其中抗原、蛋白、淀粉、纤维素等组分，提高了仔猪的消化吸收能力。

目前，发酵饲料研究与生产主要以原料发酵为主，如发酵豆粕。研究表明，固态发酵豆粕具有培养基含水量少，易于干燥；废物少，环境污染小；设备简单，操作简便，耗能低，投资少；后处理方便；产物浓度高；经济、成本低等优点[1]。同时能够应用现代固态发酵技术进行大规模生产。在选择菌种方面，国内外通常采用的菌种有：乳酸菌、酵母菌、霉菌和芽孢杆菌等[2]。乳酸菌能够代谢生成大量乳酸，降低pH值，改善风味，能够防止杂菌污染，提高发酵饲料的品质[3]。酵母在发酵过程中能够产生多种生物活性物质，有抗病、强化营养和促进生长的效果[4]。工业中通常利用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵饲料。枯草芽孢杆菌的大分子降解率较高，且耐酸碱及高温，可以以活菌的形式进入动物肠道，促进断奶仔猪的肠道发育和养分吸收[5]。

但是，有关全价配合饲料的发酵研究鲜有报道。本课题组结合固态发酵饲料的产业化实际情况，在科学设计试验方案的基础上系统地研究固态发酵仔猪配合饲料生产技术，本研究主要集中在发酵的前处理阶段对发酵产品主要营养指标（蛋白）的影响，为固态发酵仔猪配合饲料的实际生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

枯草芽孢杆菌BS-GA15购自润盈生物工程（上海）有限公司；酵母和乳酸菌由河南工业微生物菌种保藏中心提供；上述各菌种经过筛选驯化后，并加以辅料经冷冻干燥制成发酵剂（＞108CFU/g），冰箱5℃保存备用。仔猪配合饲料551H及552H由河南广安生物科技股份有限公司生产；另外，葡萄糖等试剂均为分析纯，购自郑州新丰化验器材有限公司。

1.2 主要仪器设备

SPX-250B智能型生化培养箱，上海琅玕实验设备有限公司；JJ-CJ-1FD超净工作台，吴江市净化设备总厂；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；FA2004B电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 测试方法

1.3.1 粗蛋白的测定

利用凯氏定氮法GB/T6432—1994对仔猪配合饲料或发酵产品进行粗蛋白的测定，以干基表示（P）。

蛋白增加率（%）=（P发酵后-P未发酵）/P未发酵×100

1.3.2 菌体浓度的测定

将各菌种发酵剂接种到培养液[2%（w/v）仔猪配合饲料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸馏水]中，振荡均匀，将枯草芽孢杆菌与酵母置于30℃条件下振荡培养，转速为150 r/min；将乳酸菌置于30℃条件下静置培养；不同培养时间取样（菌悬液）。

各取1 ml菌悬液，每种菌都分别稀释106、107、108倍，用微量移液器取50 μl，采用涂布法接种到固体培养基[2%（w/v）仔猪配合饲料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+2%（w/v）琼脂糖+蒸馏水]中，30 ℃条件下培养36 h，菌落计数，并计算菌体浓度（CPU/ml）。

1.4 发酵试验

取菌种发酵剂或发酵剂活化液（发酵剂接种到培养液中进行活化培养一定时间，详见1.3.2节），一定比例（108CFU/100 g饲料）接种到固态发酵培养基[仔猪配合饲料551H或552H∶蒸馏水=6∶4（w∶v），装料100 g/瓶]上。搅拌均匀后，置于30℃条件下发酵48 h，取样，50℃条件下干燥成品备用。

1.5 试验设计

1.5.1 固态发酵培养基前处理试验

试验主要研究培养基的处理方式，分灭菌（121℃）与未灭菌，其它因素还有培养基的种类及菌种，各因素的水平设置如表1所示，并进行2×2×3试验设计，每组试验均重复3次。

表1 固态发酵培养基前处理方法试验各因素与水平

1.5.2 菌种发酵剂前处理试验

试验主要研究菌种发酵剂的处理方式，分活化与未活化，其它因素还有培养基的种类及菌种，各因素的水平设置如表2所示，并进行2×2×3试验设计，每组试验均重复3次。

表2 菌种发酵剂前处理试验各因素与水平

1.6 统计方法

利用SAS 9.0软件对试验结果进行多因素方差分析（ANOVA）及最小二乘法（LSD）进行各水平之间的多重比较。

2 结果与讨论

2.1 两种仔猪配合饲料的组成比较

本研究中所选用的两种仔猪配合饲料551H及552H均是在市场上销售的商品。表3列出了两者组成。可以看出，这两种商品饲料，其主要营养组成基本相当，关键的区别是在含纤维素原料上；对于551H，配方中不含有麸皮，而552H则含有6%麸皮，而且551H中含有营养价值较高的乳清粉，以及各种营养氨基酸等；除此之外，二者各自添加了不同类型的生态添加剂。因此，这两种仔猪配合饲料体现了市面上主流仔猪料的营养组成，具有较好的代表性，可以作为本研究的主要原料。另外，从配方组成上551H更有利于年龄更小的或者说是断奶仔猪的消化吸收，而从另一个角度，可以推导出551H应该更有利于被微生物利用。

表3 仔猪配合饲料551H及552H配方

2.2 固态发酵培养基前处理对发酵的影响

对于一些饲料原料如豆粕的固态发酵，发酵前对主要培养基原料的处理主要有灭菌，其目的是为了除去豆粕中携带的杂菌，以免对发酵产生不利的影响；但是，从工业化的角度，无疑增加了工序及相应的成本。对此，本研究探讨了固态发酵培养基（主要组成为仔猪配合饲料）在发酵前进行灭菌处理对发酵产品蛋白含量的影响。如图1所示，对于不同的固态发酵基，灭菌处理对于发酵产品的蛋白影响不一样，而且不同的菌种也表现出不同的结果。通过统计分析可知（表4），前处理方式（灭菌或未灭菌）对于产品的蛋白影响显著（P＜0.05），而菌种的影响不显著（P＞0.05）；至于培养基的影响，若以蛋白含量为考察指标，则有一定的影响（0.05＜P＜0.01，接近0.05）；若以蛋白增加率为考察指标，则影响不显著。另一方面，前处理方式的两个水平中，未灭菌的培养基对于产品的蛋白含量及其增加率明显高于灭菌的培养基（P＜0.05）。

实验的结果表明，对于固态发酵仔猪配合饲料，在所选用的三种菌种情况下，对固态发酵培养基进行灭菌处理是不利于产品中蛋白的提高，反而会抑制固态发酵的进行。这与一些有关饲料原料进行灭菌处理有利于固态发酵的报道[6]不一致。具体原因可归结为：饲料原料发酵，一般组成单一，灭菌主要是消除杂菌及钝化一些抗营养因子等，有利于微生物的生长；而固态发酵仔猪配合饲料，原料的组成多样（见表3），经过高温灭菌处理，其中如维生素之类的热敏性营养因子很可能被破坏，甚至在高温下不排除各组分间发生生化反应，导致营养物质流失，不利于微生物的生长。而且，仔猪配合饲料本身作为商品，符合饲料卫生标准，本研究中所用饲料中杂菌的含量＜1 000 CPU/g，而发酵实验的结果也说明少量杂菌存在不会影响发酵的进行。因此，对于固态发酵仔猪配合饲料，固态发酵培养基前期是不需要灭菌处理的。

2.3 菌种发酵剂前处理-活化时间的确定

目前一些生产发酵饲料的企业或商家，为了减少微生物实验室方面的投资，往往购买发酵剂，直接与饲料原料进行混合发酵，从而降低发酵成本，但是发酵剂在贮运等环节很容易出现菌活降低甚至失活，导致发酵产品质量下降、发酵不易控制等问题。因此，本研究探讨了三种发酵剂接种前进行菌种活化处理。

2.3.1 枯草芽孢杆菌

两种培养液中，枯草芽孢杆菌发酵剂的菌活均随着活化时间的延长而增加，但是二者在菌体浓度上有所区别，551H培养液更有利于枯草芽孢杆菌的生长（图2）。统计分析表明，活化培养液的组成（P=0.000 6＜0.05）及活化时间（P=0.024 5＜0.05）均对该菌种的生长有显著的影响，而且培养液551H菌体浓度明显高于552H培养液（P＜0.05），活化2 h时菌体浓度最低，8 h时菌体浓度最高（P＜0.05），而2 h与4 h，4 h与6 h菌体浓度差异不显著（P＞0.05），表明2～4 h菌种生长缓慢，活化超过4 h，菌种快速生长，应是进入对数生长期，因此，枯草芽孢杆菌发酵剂菌种活化4 h即可进行固态发酵培养基接种，有利于菌种快速生长。

图1 固态发酵培养基前处理对发酵产品蛋白及其增加率的变化

表4 固态发酵培养基前处理试验方差分析结果

图2 不同培养液中枯草芽孢杆菌生长情况

2.3.2 酵母

酵母在两种培养液中的生长趋势基本一致，随着活化时间的延长，菌体浓度呈先增后降的态势，数值上并没有表现出哪一种培养液更有利于酵母的生长（见图3），统计分析结果也说明了两种培养液对于酵母的生长无显著影响（P=0.279 7＞0.05），但活化时间对其的生长有一定的影响（P=0.053 4＜0.1）。酵母活化2 h时的菌体浓度较低，与8 h基本相当（P＞0.05），而活化4 h与6 h所测得的菌体浓度最高（P＜0.05），但是二者之间并无明显的区别（P＞0.05）。这些分析结果表明，酵母在本研究的两种培养液中活化，在2～4 h内就能进入快速生长期，再延长活化时间，反而菌体生长缓慢，甚至出现浓度降低不生长的情况。因此，对于酵母发酵剂的活化时间应控制在2～4 h，此时培养液中酵母生长快速，接种到固态培养基有利于菌种的快速生长。

2.3.3 乳酸菌

乳酸菌在两种培养液中生长趋势在前6 h内基本一致，菌体浓度均是先增后减，而活化时间到8 h，551H培养液出现菌体浓度快速上涨的态势，而552H培养液与之相反（见图4）。不过，通过统计分析，所研究的两种培养液（P=0.271 0＞0.05）及活化时间（P=0.684 3＞0.05）均对乳酸菌的生长影响不显著。但是，从菌体浓度数值上看，与枯草芽孢杆菌相当（见图2），高于酵母（见图3）。因此，乳酸菌的活化时间在4 h内，两种培养液中均能获得较高的菌体浓度，此时接种到固态培养基乳酸菌能快速生长。

图3 不同培养液中酵母生长情况

图4 不同培养液中乳酸菌生长情况

从上述的研究中可发现，三种菌种在两种培养液中的生长均有一个菌体浓度增长期，不同的菌种可能活化时间不一致，但这个时间基本上可在4 h内完成，再增加活化时间，各菌种表现出不同的生长特性：对于枯草芽孢杆菌则出现快速生长，而对于其它两种菌种则不同程度地出现生长缓慢甚至不生长的状况。这应与菌种的特性有关：枯草芽孢杆菌好氧型，随着活化的进行，氧气在不断进入，导致后期生长旺盛；而另外属兼氧或厌氧型，对于氧气的需求不是那么迫切，因此，后期氧气的存在或多或少起到抑制生长的作用。当然，有关此方面的微生物生长机制仍需进一步研究。

2.4 菌种发酵剂前处理对发酵的影响

通过菌种的活化研究，可以确定3种菌种活化时间应控制在4 h内，均具有较高的菌体浓度，但是，经过活化后的菌种液接种固态发酵培养基发酵效果是否优于未经活化的菌种发酵剂不能确定，而且经过菌种活化在工业上会增加生产工序，从而增加生产成本。对此，本研究设计了相关试验。结果如图5所示，对于两种固态培养基（551H与552H），菌种活化接种发酵后均不同程度表现蛋白含量及其增长率较未经活化的高。统计分析结果表明(见表5)，菌种的处理方式（活化与未活化）显著影响着发酵产品的蛋白含量及其增长率（P＜0.05），而且，经过活化后所得产品蛋白含量及其增长明显高于未活化后得的产品（P＜0.05）；而培养基的影响具有选择性，对于蛋白含量，其影响显著（P＜0.05），且551H固态发酵基所获得产品具较高的蛋白含量（P＜0.05）；另一方面，对于蛋白增加率，固态培养基对发酵产品无显著影响（P＞0.05）；至于菌种，发现3种菌种对于发酵产品也无显著影响。

研究结果表明，菌种经过前期活化后接种到固态培养基，大大缩短了菌种在新环境下的适应期，能够快速生产，而且活化后的菌种液更有利于与固态培养基混合均匀。因此，相同的发酵时间内，接种未经活化的菌种发酵剂所得的产品在蛋白含量及其增长率明显低于活化的菌种，提高了发酵速度。固态发酵培养基的组成一定程度上影响着发酵产品的品质，尤其是蛋白含量，这印证了上述仔猪配合饲料551H更有利于被微生物利用的推导。

3 结论

基于工业生产的应用实际，对具有市场代表性的仔猪配合饲料551H及552H固态发酵技术的前处理工序进行了研究，得到如下结论：

①以仔猪配合饲料为主要组成的固态发酵培养基，发酵前不需要经过灭菌处理，有利于后续固态发酵的进行，且发酵产品中蛋白含量及其增长率明显提高。

②以仔猪配合饲料为主要组成的菌种培养液，在4 h活化时间内，均能让枯草芽孢杆菌、酵母及乳酸菌的菌体浓度达到较高水平。

图5 菌种活化对发酵产品蛋白及其增加率的变化

表5 菌种活化试验方差分析结果

③菌种发酵剂经过活化后接种固态培养基，提高了固态发酵速度，发酵产品中蛋白含量及其增长率明显提高。

④菌种的种类在上述前处理技术中对于发酵产品的影响不明显，而饲料的种类对于发酵产品的蛋白含量有一定的影响。

因此，该研究结果将为工业化固态发酵仔猪配合饲料的前处理工序提供实验与理论支撑，但是实际应用中如何优化各种工艺参数、成本控制等问题需要进一步研究。