微量元素和发酵增效剂影响金色链霉菌发酵研究
2018-12-29黄文福孙金刚张瑞敏
■黄文福 牛 春 孙金刚 张瑞敏 张 萍
（宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏银川750100）
金色链霉菌（Streptomyces aureus）是链霉菌（Streptomyces）的一种，因能产生金霉素（Chlortetracycline，即CTC）而得名。金霉素是属于四环素类的一种广谱抗生素，在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途，尤其在畜牧业上是用于饲料药物添加剂的八大抗生素产品之一[1]。为了提高金霉素的产量，从很多角度进行了探索。一方面，通过不断对金色链霉菌品种的改良，获得高效价稳定的菌株；另一方面，通过先进的科学技术不断对金色链霉菌的发酵工艺进行优化，以期待得到更高的金霉素产出率。
本研究主要以金色链霉菌抗性菌为试验菌株，通过向基础发酵培养基中添加微量元素，对发酵培养基配方进行优化；同时探索发酵增效剂在优化配方中的添加对金霉素发酵效价的提高效果，为工业生产中提高金霉素产出率提供一定的理论基础和参考指标。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
金色链霉菌抗性菌(Streptomyces aureus)CTCⅡ15-590由宁夏泰瑞制药股份有限公司技术研发中心保存。
1.1.2 培养基及培养条件参考轩海连的方法[2]
1.1.2.1 种子培养基
玉米淀粉4.0%、黄豆粉2.0%、氯化钠0.2%、硫酸铵0.3%、碳酸钙0.4%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、硫酸镁0.025%、磷酸二氢钾0.025%、培养基装量30 ml/300 ml三角瓶，在温度(29.0±0.5)℃，转速260 r/min条件下培养22 h。
1.1.2.2 发酵培养基
玉米淀粉10%、花生粉1.5%、黄豆粉2.5%、淀粉酶(沈丘酶制剂厂生产，酶活2 000 IU/ml)0.004%、氯化钠0.25%、硫酸铵0.5%、碳酸钙0.7%、蛋白胨1.4%、酵母粉0.2%、硫酸镁0.025%、豆油1.25 ml/30 ml培养基，培养基装量30 ml/300 ml三角瓶，在温度(29.0±0.5)℃,转速260 r/min条件下培养166 h。
1.1.3 试剂
硫酸亚铁、硫酸铜、盐酸甜菜碱和氯化钴均为分析纯；发酵增效剂均购于四川乐山市五通桥生物化工厂。
1.2 方法
1.2.1 斜面制备
将沙土孢子传到斜面培养基上培养96 h后，保藏待用。
1.2.2 摇瓶发酵方法
首先，用无菌水将斜面上成熟的孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌50 ml三角瓶中，在摇床上振荡10～20 min，使孢子充分分散，得到孢子悬液。其次，将1 ml孢子悬液转入灭菌的装有种子培养基的300 ml三角瓶中，培养22 h。最后，将培养好的种子培养液以体积分数12%的接种量转入灭菌的装有添加不同浓度梯度的微量元素与发酵增效剂的发酵培养基的300 ml三角瓶中，用正常培养基作为对照，培养166 h。
1.2.3 单因素和正交试验设计
单因素试验设计是目前最普遍采用的一种试验方法设计，它仅考察一个因素对试验指标构成影响。本文首先对4种微量元素和6种发酵增效剂进行单因素考察。试验因素和水平见表1和表2。
表1 因素(微量元素)-水平
表2 因素(发酵增效剂)-水平
正交试验设计[3]是研究多因素多水平以部分代表性的点代替全面试验，寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。分别选取3种微量元素进行三因素三水平的正交试验试验考察。最后得到最优的水平组合,试验因素和水平见表3。
表3 三因素(微量元素)三水平正交试验
1.2.4 检测方法
发酵液中金霉素发酵单位采用比色法测定，待发酵结束，将发酵摇瓶置于平板上，向摇瓶的发酵液中加入适量固体草酸并混匀，酸化30 min后,将发酵液过滤；吸取0.1 ml滤液，加入到准备好的50 ml容量瓶（预先加入2 mol/l盐酸5 ml）中，热水浴5 min；待溶液冷却后，加纯化水定容至50 ml，空白不进行水浴；用分光光度计于波长440 nm下测定紫外吸收值(OD值)，由标准曲线计算发酵单位。
1.2.5 统计方法
数据均采用Spass软件进行统计分析，用Excel软件作图。
2 结果与分析
2.1 硫酸铜、硫酸亚铁、盐酸甜菜碱和氯化钴对金色链霉菌发酵效价的影响
由图1可以看出，硫酸亚铁、硫酸铜和盐酸甜菜碱对金色链霉菌摇瓶发酵效价有促进作用，而氯化钴对其有抑制作用。硫酸亚铁在浓度0.002%时促进作用最明显，较对照提高15.9%；硫酸铜在浓度0.005%时促进作用最明显，较对照提高6.9%；盐酸甜菜碱在浓度0.03%时促进作用最明显，较对照提高9.6%；而氯化钴在浓度0.004%时抑制作用最为明显，较对照降低28.3%。因此可在基础发酵培养基中加入一定浓度梯度的硫酸亚铁、硫酸铜和盐酸甜菜碱以提高发酵效价。
图1 4种微量元素对金色链霉菌发酵效价的影响
2.2 微量元素组合对金色链霉菌发酵效价的影响
由表4试验数据可知，A1平均发酵效价为8 973 U/ml，A2平均发酵效价为8 632 U/ml，A3平均发酵效价为 8 497 U/ml，极差为 476 U/ml；B1平均发酵效价为8 927 U/ml，B2平均发酵效价为8 703 U/ml，B3平均发酵效价为 8 476 U/ml，极差为 451 U/ml；C1平均发酵效价为8 803 U/ml，C2平均发酵效价为8 842 U/ml，C3平均发酵效价为 8 459 U/ml，极差为383 U/ml；因此，各因素对发酵效价指标影响的主次顺序依次为：A＞B＞C。则选取最优的组合条件是A1B1C2，即在基础发酵培养基中添加0.001%硫酸亚铁、0.004%硫酸铜和0.03%盐酸甜菜碱。
表4 微量元素组合影响金色链霉菌发酵效价 L9(34)正交试验方案及计算表
2.3 发酵增效剂对金色链霉菌发酵效价的影响（见图2）
由图2可以看出，G型发酵增效剂对摇瓶效价影响有一定的作用，低浓度时具有促进作用，在0.02%浓度时促进作用最明显，较对照高8.1%。F型发酵增效剂对摇瓶效价影响有一定的作用，低浓度时具有促进作用，在0.02%浓度时促进作用最明显，较对照高7.2%。菜籽饼粉发酵增效剂对摇瓶效价影响有一定的作用，高浓度时具有抑制作用；在0.04%浓度时抑制作用最明显，较对照低9.9%。A型发酵增效剂对摇瓶效价影响有促进作用。E型发酵增效剂对摇瓶效价影响无变化。甲型发酵增效剂对摇瓶效价影响有一定的作用，低浓度时具有促进作用，在0.01%浓度时促进作用最明显，较对照高9.1%。因此，可以在发酵过程中，添加一定浓度的G型发酵增效剂、F型发酵增效剂和甲型发酵增效剂以提高发酵效价。
图2 6种发酵增效剂对金色链霉菌发酵效价的影响
2.4 微量元素与发酵增效剂组合对金色链霉菌发酵效价的影响（见图3）
图3 微量元素和发酵增效剂组合对金色链霉菌发酵效价影响
由图3可知，A、B、C和D四组试验组的摇瓶发酵效价均高于对照组，且与对照组之间差异显著。A组与B组和D组的摇瓶发酵效价之间差异显著，与C组摇瓶发酵效价差异不显著。B、C组和D组之间的摇瓶发酵效价差异不显著，但D组摇瓶发酵效价高于C组和B组。A组发酵效价比CK组高17.3%；B组发酵效价比A组提高5.1%；C组发酵效价比A组提高了3.4%，D组发酵效价比A组提高了6.4%。因此，添加一定量的微量元素和发酵增效剂可以提高金色链霉菌的生产发酵能力。
3 结论与讨论
金霉素的生物合成过程受多种酶的控制和调节，扶教龙等[4]已证明在培养48 h以上的过程菌株中丙酮酸激酶和丙酮酸脱氧酶的活力都很低。同时，在金色链霉菌发酵过程中，特别是金霉素合成的旺盛期，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力很高。而金属离子对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有较强的激活作用。王鹏飞[5]已证明在72 h添加1 mg/kg一水硫酸亚铁1.4 ml，或在72 h加l%七水硫酸镁0.5 ml均可使金霉素的发酵水平得到较大幅度提高。另一方面，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为参与四环类抗生素生物合成过程最后几步反应的酶，如SAM供给不足，四环类抗生素合成则受到影响[5]。甜菜碱及其盐酸盐作为一种高活性甲基供体，在甲基代谢中起着重要的营养调控作用，通过甲基循环途径，甜菜碱实现3个活性甲基对甲基受体的供给[6]。应惟娲等[7]指出，甜菜碱是最有效的甲基供体，它的三个甲基基团都可以作为有效的活性甲基，其中一个使高半胱氨酸甲基化，形成内源甲硫氨酸和二甲基甘氨酸，内源甲硫氨酸通过形成S-腺苷甲硫氨酸释放甲基，二甲基甘氨酸通过释放甲基形成5-甲基四氢叶酸，而5-甲基四氢叶酸又是高半胱氨酸合成甲硫氨酸的甲基供体，甲硫氨酸必须经甲基循环转变成S-腺苷甲硫氨酸，才能作为甲基供体。甜菜碱能代替价格较高的S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，降低生产成本。因此，本文通过向基础发酵培养基中添加硫酸铜、硫酸亚铁和盐酸甜菜碱，使得金色链霉菌的发酵效价提高了17.3%。进一步在优化培养基中添加一定发酵增效剂，可以显著提高金色链霉菌的生产发酵水平，分别添加0.02%G型发酵增效剂、0.02%F型发酵增效剂和0.01%甲型发酵增效剂，可使发酵效价又提高5.1%、3.4%和6.4%。
