响应面法优化黑曲霉固态发酵冬凌草的研究

■汪伦记 赵亚美 樊家康

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023）

畜牧业是我国农业产业中的支柱性产业。在动物生产中，抗生素作为饲料添加剂得到广泛应用，给畜牧业带来极大的经济效益的同时，也造成抗生素残留、耐药菌株的产生和流行等食品安全问题[1-2]。欧盟和美国先后已禁止抗生素作为饲料添加剂使用。近年来，植物提取物以其安全、高效、无残留、不产生抗药性等优势，成为一种新型抗生素替代品[3]。中草药作为抗生素替代品已开始在养殖业中得到应用[4]。本研究选择的冬凌草为我国特色中草药，其含有二萜、三萜等多种萜类化合物以及甾体、黄酮、挥发油、生物碱和多糖等多种活性物质。现代药理学和毒理学研究表明，冬凌草具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗突变、调节免疫等生物活性。由于其具有显著的抗菌消炎作用，冬凌草也被称为“绿色抗生素”。作者的前期研究结果也表明，冬凌草对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水单胞菌、哈氏弧菌和鼠伤寒沙门氏菌等人畜共患病原菌具有一定的抑制作用[5]。

中草药经微生物发酵后，可以增加有效成分的利用率，提高药效。微生物细胞含有的丰富酶系可以对中草药的活性成分进行修饰，使其产生新的药效物质，同时可减少中草药的毒副作用，节约资源[6]。因此，本文对饲用微生物黑曲霉固态发酵冬凌草的条件和营养成分的变化进行了研究，为冬凌草在畜禽生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

冬凌草购于洛阳，干燥后经中药粉碎机粉碎，过60目筛；麸皮，购于洛阳；NaNO3、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、K2HPO4、NaOH、H2SO4、冰乙酸、乙酸钠、丙酮、石油醚、苯酚、无水亚硫酸钠、琼脂粉、葡萄糖均为分析纯，购于天津市德恩化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸、四水酒石酸钾钠、羧甲基纤维素钠均为分析纯，购于上海强顺化学试剂有限公司。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），河南科技大学食品与生物工程学院实验教学中心保藏。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）购自中国微生物菌种保藏中心，黑曲霉（Aspergillus nigerACCC 32589），购于中国农业微生物菌种保藏管理中心；菌种经斜面培养活化后，4℃冰箱保存备用。

1.1.2 仪器与设备

XMTD-8222电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；MJX-160B-Z霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-20双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HJ-2A数显恒温磁力加热搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂；FA2004N电子天平，上海菁海仪器有限公司；H1850R离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；PHS-3CpH计，上海智光仪器仪表有限公司；紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基础营养盐液的制备

NaNO33 g/l、MgSO4·7H2O 0.5 g/l、KCl 0.5 g/l、Fe-SO4·7H2O 0.01 g/l、K2HPO41 g/l，用3 mol/l盐酸调成所需pH值。

1.2.2 培养基

① 细菌斜面培养基：蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母膏5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 ml，用1 mol/l的NaOH溶液调节pH值7.2～7.4。121℃灭菌20 min备用。

② 细菌液体培养基：蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母膏5 g、蒸馏水1 000 ml，用1 mol/l的NaOH溶液调节pH值7.2～7.4。121℃灭菌20 min备用。

③ 细菌平板培养基：蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母膏5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 ml，用1 mol/l的NaOH溶液调节pH值7.2～7.4。121℃灭菌20 min备用。

④PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、自来水1 000 ml，自然pH值。121 ℃灭菌20 min备用。

1.2.3 细菌悬液制备

挑取1～2环接入细菌斜面培养基上，37℃培养24 h后，用无菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液。采用麦氏比浊法，用无菌生理盐水调节细菌含量为1×108cfu/ml。

1.2.4 抑菌试验

①冬凌草醇提物溶液制备：分别取发酵前和发酵后的冬凌草500 g，干燥后经中药粉碎机粉碎，用95%乙醇在室温下浸泡提取3次，合并提取液后减压浓缩得到无醇味浸膏。取制备适量的冬凌草醇提物，用甲醇溶解后，配成不同质量浓度的溶液，经细菌过滤器过滤除菌后，4℃保存备用。

②抑菌试验：灭菌吸管吸取制备的菌悬液1 ml加入100 ml已融化并保温在水浴中（48～50℃）的细菌平板培养基内，使菌含量达到1×106cfu/ml。融化后固体平板培养基冷却45℃左右，加入1 ml制备好的菌液，然后倒入无菌培养皿中，静置冷却，等其凝固后，用无菌镊子将灭菌牛津杯垂直放在含菌平板培养基表面，轻轻按压（每个平板放4个牛津杯）。用移液器吸取100 μl冬凌草醇提物溶液，加入到牛津杯孔内，同时用甲醇做空白对照。然后，将培养皿放入培养箱中，细菌37℃培养15h后测量抑菌圈直径。

1.2.5 黑曲霉孢子悬液的制备

从冰箱取出一支保存的黑曲霉试管斜面，在超净工作台中加入无菌水，使无菌水刚好没过斜面上的全部黑曲霉，然后用接种环把黑曲霉从斜面上轻轻刮下来，制成黑曲霉孢子悬液。

1.2.6 固态发酵工艺流程

称取冬凌草和麸皮于250 ml三角烧瓶中，装瓶量为20 g，加入基础营养盐液，用玻璃棒搅拌均匀，然后用透气封口膜封口，于灭菌锅内121℃灭菌20 min。灭菌完成后，在超净工作台中，用移液枪吸取所需体积的黑曲霉孢子悬液于三角烧瓶中，用灭过菌的玻璃棒搅拌均匀，用封口膜封口后，放入霉菌培养箱培养72 h，间隔一定时间摇动拍打三角烧瓶，使均匀发酵。发酵结束后，测定发酵产物中纤维素酶活力，探究最优发酵条件。

1.2.7 固态发酵单因素实验

①接种量对固态发酵的影响

冬凌草与麸皮比1∶4(g∶g)，固液比为2∶1(g∶ml)，培养温度28℃，基础营养盐液pH值8，接种量分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，每组3个重复。

②温度对固态发酵的影响

冬凌草与麸皮比1∶4(g∶g)，固液比为2∶1(g∶ml)，基础营养盐液pH值8，接种量1.5%，培养温度分别为25、28、31、34、37℃，每组3个重复。

③pH值对固态发酵的影响

冬凌草与麸皮比1∶4(g∶g)，固液比为2∶1(g∶ml)，培养温度31℃，接种量1.5%，基础营养盐液pH值分别为4、5、6、7、8，每组3个重复。

④冬凌草与麸皮比对固态发酵的影响

固液比为2∶1（g∶ml），培养温度31 ℃，接种量1.5%，基础营养盐液pH值7，冬凌草与麸皮比（g∶g）分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，每组3个重复。

⑤固液比对固态发酵的影响

培养温度31℃，接种量1.5%，基础营养盐液pH值7，冬凌草与麸皮比1∶4，固液比（g∶ml）分别为2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，每组3个重复。

1.2.8 响应曲面法优化固态发酵条件的实验设计

根据单因素实验结果，选取冬凌草与麸皮比A、固液比B和接种量C为影响因素，以纤维素酶活力Y为响应值，采用Box-Behnken实验设计[7]，进行三因素三水平的响应面分析，确定最优固态发酵条件参数，如表1所示。

表1 Box-Behnken实验设计因素水平

1.2.9 纤维素酶活力的测定

按照NY/T 912—2004《饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度计法》测定纤维素酶活力[8]。

纤维素酶活力单位：在37℃，pH值5.5的条件下，每分钟从浓度为4 mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

纤维素酶液的制备：固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛，称取试样2份，精确至0.001 g。加入40 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液定容至100 ml，在4℃条件下避光保存24 h。摇匀，取出30～50 ml，离心机离心3 min。吸取5 ml上清液，再用缓冲溶液做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04～0.08U/ml）。

试样酶活力的计算：

式中：XD——试样稀释液的纤维素酶活力(U/ml)；

AE——酶反应液的吸光度；

AB——酶空白样的吸光度；

K——标准曲线的斜率；

M——葡萄糖的摩尔质量M(C6H12O6)=180.2g/mol;

t——酶解反应时间(min)；

1 000 ——转换因子，1mmol=1 000μmol；

C0——标准曲线截距。

式中：X——试样纤维素酶的活力(U/g)；

Df——试样的总稀释倍数。

绘制的葡萄糖标准曲线为y=0.907 9x+0.104 3，R2=0.999 4。

1.2.10 饲料各种指标测定

粗纤维按照GB/T 6434—2006/ISO 6865:2000《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》；粗灰分按照GB/T 6438—2007/ISO 5984:2002《饲料中粗灰分的测定》；粗脂肪按照GB/T 6433—2006/ISO 6492:1999《饲料中粗脂肪的测定》；粗蛋白质按照GB/T 6432—94《饲料中粗蛋白测定方法》；还原糖采用DNS法（3,5-二硝基水杨酸比色法）[9]，绘制的葡萄糖标准曲线为y=1.267x+0.035 8，R2=0.999 1。

1.2.11 数据分析

实验数据以“平均数±标准差”的形式表示。采用统计分析软件Design Expert8.0对试验数据进行分析。

2 结果

2.1 黑曲霉固态发酵冬凌草的单因素实验

冬凌草与麸皮的比、接种量、温度、pH值和固液比对固态发酵的影响见图1。由图1(a)可知，随着接种量的增加，纤维素酶活力呈现先增大后减小的趋势，当接种量为1.5%时，纤维素酶活力达到最大值。由图1(b)可知，随着温度的增加，纤维素酶活力呈现先增大后减小的趋势，当温度为31℃时，纤维素酶活力达到最大值。图1(c)显示，当基础营养盐液的pH值为7时，纤维素酶活力达到最大值。图1(d)显示冬凌草与麸皮比为1∶4时，纤维素酶活力达到最大值。图1(e)显示纤维素酶活力随着固液比的增大而呈现先增大后减小的趋势，当固液比为1∶1.5时达到最大值。

图1 黑曲霉固态发酵冬凌草的单因素实验

2.2 黑曲霉固态发酵冬凌草的响应面实验

根据单因素实验结果，确定固态发酵温度为31℃，基础营养盐液pH值7。以冬凌草与麸皮比（A）、固液比（B）和接种量(C)为自变量，以纤维素酶活力（Y）为响应值，以Design-Expert8.0软件，采用Box-Behnken实验设计，进行响应面分析，实验设计与结果如表2所示。

采用Design-Expert8.0软件对以上的实验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程[10]，多元回归分析得到纤维素酶活力与各因素变量的二次方程模型为：

并对该模型进行方差分析，各项回归系数及显著性检验结果见表3。由表3可知，回归模型显著（P＜0.000 1），并且失拟项不显著（P=0.100 2＞0.05），R2=0.975 7、R2Adj=0.944 5，说明此模型能解释94.45%响应区面的变化，多项回归方程与实际数据拟合良好，因此该模型可以真实地拟合和预测实际情况。从回归方程系数显著性检验可知：一次项A、B，二次项A2、B2对纤维素酶活力影响极显著，二次项C2对纤维素酶活力影响显著，其余项的影响均不显著。由此可见，冬凌草与麸皮比、固液比对纤维素酶活力影响极显著，接种量对纤维素酶活力影响不显著。3个因素影响酶活力大小的主次依次为：B＞A＞C，即固液比＞冬凌草与麸皮比＞接种量。

为了考察各因素交互作用对纤维素酶活力的影响，对模型进行降维分析[11]，研究接种量、固液比、冬凌草与麸皮比两两因素之间的交互作用，其对应的响应面及等高线图如图2所示。

由图2(a)的响应面图可以看出：固液比对纤维素酶活力的影响较显著，曲面较陡，随着固液比的增大，纤维素酶活力呈现先快速增加后缓慢降低的趋势；冬凌草与麸皮比对纤维素酶活力的影响不太显著，曲面较缓和，随着冬凌草与麸皮比的增大，纤维素酶活力呈现先增大后减小的趋势。由图2(a)的等高线图可以看出，沿固液比轴向等高线密集，而冬凌草与麸皮比轴向等高线相对稀疏，说明固液比对纤维素酶活力的影响比冬凌草与麸皮比大，等高线呈椭圆形，说明两因素的交互作用较显著。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 方差分析

由图2(b)的响应面图可以看出，冬凌草与麸皮比对纤维素酶活力的影响较显著，曲面较陡，随着冬凌草与麸皮比的增大，纤维素酶活力呈现先快速增加后快速下降的趋势；接种量对纤维素酶活力的影响不太显著，曲面较缓和，随着接种量的增加，纤维素酶活力呈现先缓慢增加后缓慢减小的趋势。由图2(b)的等高线图可以看出，沿冬凌草与麸皮比轴向等高线密集，而接种量轴向等高线相对稀疏，说明冬凌草与麸皮比对纤维素酶活力的影响比接种量大，等高线呈近似椭圆形，说明两因素具有一定的交互作用。

由图2(c)的响应面图可以看出，固液比对纤维素酶活力的影响较显著，曲面较陡，随着固液比的增大，纤维素酶活力呈现先快速增加后缓慢降低的趋势；接种量对纤维素酶活力的影响不太显著，曲面较缓和，随着接种量的增大，纤维素酶活力呈现先缓慢增大后缓慢减小的趋势。由图2(c)的等高线图可以看出，沿固液比轴向等高线密集，而接种量轴向等高线相对稀疏，说明固液比对纤维素酶活力的影响比接种量大，等高线呈椭圆形，说明两因素的交互作用较显著。

图2 各因素间交互作用的响应面和等高线图

根据回归模型，通过Design Expert 8.0软件分析得出黑曲霉固态发酵冬凌草的最优条件为：冬凌草与麸皮比为1∶3.86（g∶g），固液比为1∶1.73（g∶ml），接种量为1.59%，预测得到的纤维素酶活力为16.67 U/g。对该最优条件进行模型验证实验，考虑到实际操作的便利，将最优条件参数修正为：冬凌草与麸皮比为1∶3.9（g∶g），固液比为 1∶1.7（g∶ml），接种量为1.6%，通过三组重复实验得到纤维素酶活力的平均值为16.49 U/g，比理论值下降1.08%，小于5%，实验值与理论值基本吻合，说明预测模型与实际情况拟合良好。

2.3 黑曲霉固态发酵冬凌草前后成分变化(见表4)

表4 发酵前后营养成分对比(%)

由表4可知，冬凌草经黑曲霉固态发酵后，粗纤维由发酵前的34.35%降低到31.07%，降低了9.55%；粗灰分由发酵前的7.81%降低到5.69%，降低了27.14%；还原糖由发酵前的3.92%降低到1.13%，降低了71.17%；粗脂肪由发酵前的2.87%增加到3.35%，增加了16.72%；粗蛋白质由发酵前的10.62%增加到12.95%，增加了21.94%，营养价值有了明显的提高。

以S.aureus、E.coli、B.subtilis、S.epidermidis、P.multocida为供试菌。对冬凌草发酵前后的抑菌活性进行了分析，实验结果见表5。由表5可知，冬凌草发酵后的醇提物对S.aureus、B.subtilis、S.epidermidis、P.multocida、E.coli的抑制作用表现出增强作用。

表5 冬凌草醇提物的抑菌作用（平均数±标准差，n=9）

3 讨论

3.1 黑曲霉固态发酵冬凌草的条件优化

冬凌草为一种多年生的草本植物，含有难分解利用的纤维素与半纤维素。因此，筛选适宜发酵的菌种，对培养基和发酵条件进行优化，可以最大限度地利用以中药材为主要组分的培养基，释放和产生更多的活性物质。黑曲霉是一种饲用真核微生物，能产生分解纤维素、半纤维素、蛋白质和脂类等物质的酶类，对纤维素具有较强的分解利用能力，是发酵中药的主要功能菌。本实验中以冬凌草为原料，同时添加适量的麸皮作为辅料，接种黑曲霉进行固态发酵时，由于麸皮含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素等营养物质，黑曲霉生长良好，纤维素酶的活性也较高。

3.2 黑曲霉固态发酵冬凌草前后成分变化

中草药经饲用微生物发酵后，由于微生物生长过程中分泌分解纤维素和木质素的酶，因此，能将中草药中的纤维素、木质素类等大分子物质降解，同时也可将中草药转化为菌体蛋白和多糖等，并使中药充分释放有效成分，提高其有效成分的含量。本实验中，以冬凌草为主料，麸皮为辅料，经黑曲霉固态发酵后，发酵物中粗纤维、粗灰分和还原糖含量降低，而粗脂肪和粗蛋白质含量得到增加。对冬凌草发酵后的醇提物抑菌试验显示，其抑菌活性表现出增强作用，表明冬凌草经过黑曲霉固态发酵后，其抑菌活性成分更容易释放出来。

4 结论

通过单因素和响应曲面实验，对黑曲霉固态发酵冬凌草的条件进行了优化。获得最佳条件为：冬凌草与麸皮比为1∶3.9（g∶g），固液比为1∶1.7（g∶ml），接种量为1.6%，基础营养盐液pH值7，发酵温度为31℃。在此培养条件下，黑曲霉发酵产纤维素酶的活力最高，发酵72 h，纤维素酶活力达到了16.49 U/g。对黑曲霉固态发酵冬凌草的成分进行了分析，结果显示，粗纤维含量降低了9.55%；粗灰分下降了27.14%，还原糖减少了71.17%；粗脂肪含量增加了16.72%；粗蛋白质含量增加了21.94%，营养价值有了一定提高。冬凌草发酵后的醇提物对S.aureus、B.subtilis、S.epidermidis、P.multocida、E.coli的抑制作用表现出增强作用。