2种芽孢杆菌属细菌对洋葱根系遭受铜胁迫的缓解作用

任彩婷 ，王 鲁 ，庞亚琴 ，徐秋曼

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

铜是维持植物生长发育所必需的微量元素之一，参与植物体内的多个生理过程.近年来，随着工农业生产的快速发展和含铜矿产的开采，土壤中含铜量达到原始土壤的几倍甚至几十倍，严重威胁到生态系统的稳定和安全[1-2].土壤中过量的铜一方面会对植物产生毒害，影响植物的代谢机制，甚至抑制植物生长发育[3-5]；另一方面，铜会通过食物链进入人体，最终危害人体健康[6-7].因此铜污染问题引起了许多学者的关注，铜对各种作物的影响也多见报道[8-10].

采用物理或化学方法治理土壤重金属污染所需成本较高，而且容易产生二次污染，治理效果不理想，因此近年来人们把研究方向转移到生物修复和防治.芽孢杆菌属（Bacillus）细菌具有生长速度快、营养需求简单、在植物表面易于存活与繁殖、制剂稳定、施用方便等优点[11].芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤中广泛分布的一种需氧型细菌，除对人畜无害和不污染环境之外，还对生活在重金属污染土壤上的植物有生长促进作用，因此在防治植物病虫害和修复土壤重金属污染方面受到了广泛关注[12-15].如肖亚静等[16]研究表明，枯草芽孢杆菌21可以提高玉米各组织中的POD活性和地下组织中的CAT活性；范仲学等[17]发现，每千克土壤中施用2 g枯草芽孢杆菌可以提高花生的主茎高、侧枝长、植株鲜重、单株果重和饱果率，使籽粒中镉的积累量降低25.37%.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）也是芽孢杆菌属中的一种好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，与枯草芽孢杆菌具有很高的亲缘性，目前关于解淀粉芽孢杆菌的生防多集中在植物病害防治、果蔬保鲜、增加抗盐性等方面[18-19]，在防治重金属污染方面还鲜见报道.

洋葱（Allium cepa L.），又名葱头，属百合科葱属二年生草本植物[20]，是世界上主要的蔬菜品种，也是中国主要栽培和出口蔬菜品种，具有抗菌、预防心血管疾病、降血糖、抗氧化的保健功能[21-22].洋葱容易培养、根系发达、染色体数目较少，但对环境变化敏感，是环境监测的优选植物[23].纳明亮[24]曾研究了铜、锌、铅对洋葱、番茄、黄瓜等蔬菜的毒性效应，发现褐土和黄泥土基质中，洋葱对铜的毒性响应最敏感.本课题组以洋葱为实验材料，研究枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌对重金属铜胁迫下洋葱根系生长、生理活性以及根尖细胞有丝分裂的影响，以期为植物的铜胁迫损伤修复和芽孢杆菌属细菌发酵液在农业生产中的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

洋葱，购自市场，栽种地附近没有污染源.

解淀粉芽孢杆菌HM618和枯草芽孢杆菌77发酵液均由天津大学程景胜课题组提供.解淀粉芽孢杆菌HM618纯培养发酵液，记为HM；枯草芽孢杆菌77纯培养发酵液，记为BS；解淀粉芽孢杆菌HM618和枯草芽孢杆菌77混合培养发酵液，记为HM+BS.

1.2 方法

1.2.1 洋葱的培养与处理

选取完好无损、大小均匀的洋葱，剥掉外层的干燥鳞茎，去掉老根，置于盛有自来水的烧杯上，在室温条件下进行生根培养，每24 h换一次水.待根尖长至2～3 cm，从中选取生长一致的40头洋葱，平均分成8组，分别为对照组（CK）、CK+HM、CK+BS、CK+HM+BS、Cu、Cu+HM、Cu+BS、Cu+HM+BS.将 CuSO4·5H2O用蒸馏水配成浓度为40μmol/L的溶液，将发酵液均稀释10倍.将分组后的洋葱移至盛有硫酸铜溶液和细菌发酵液的50 mL烧杯中进行培养，每24 h更换一次处理液.

1.2.2 洋葱根长的测量

在处理7 d后测量洋葱的根长，每个处理组随机选取15条根进行测量.

1.2.3 相对电导率和丙二醛含量的测定

分别在处理 4、5、6、7 d 后，称取 0.2 g根，在每一个试管中放入8 mL蒸馏水，放置4 h后，测定电导率R1.然后将试管放于沸水浴中加热10 min，迅速冷却至室温，测其电导率R2.按下列公式计算相对电导率（Relative conductivity，REC），进行3次平行处理.根据张志良等[25]的方法测定丙二醛（MDA）含量.

1.2.4 根尖细胞染色体形态的观察

分别在铜处理 24、48、72 h 后，于 11 ∶00—13 ∶00取材，每个处理组中随机挑选5个根尖，水洗后，置于卡诺氏固定液中固定24 h，之后移入70%（体积分数）乙醇中，于4℃冰箱中保存.制片时，先用蒸馏水冲洗根尖，然后将根尖放入盛有1 mol/L HCl的试管中，在60℃恒温水浴条件下解离5～6 min.用改良苯酚品红染色液染色10～15 min，镜检，观察细胞分裂是否有异常.统计出细胞分裂的个数，计算有丝分裂指数和染色体畸变率，计算公式如下：

1.3 数据统计分析

采用SPSS 22.0对数据进行差异统计学分析，用Excel程序作图.

2 结果与分析

2.1 不同处理下洋葱根尖的生长

用不同的处理液处理洋葱7 d后，各处理组中的根长如图1所示.由图1可以看出，当铜胁迫不存在时，培养液中添加解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液均不会影响洋葱根的生长，但同时添加2种发酵液则对洋葱生长有显著抑制作用（P<0.05）.当洋葱用含有40 μmol/L CuSO4·5H2O的培养液处理7 d后，根长远远低于对照组的根长，可见洋葱遭受了非常严重的铜胁迫.添加了解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液的处理组中，洋葱根长显著增加，比未添加发酵液处理组的根长分别提高了70.59%和177.94%，但仍然显著低于未添加CuSO4·5H2O的处理组.同时添加2种发酵液的处理则对洋葱遭受的铜胁迫不产生缓解作用.总的来看，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均对铜胁迫下洋葱根的生长有促进作用，且后者的作用效果更显著，但不能完全解除铜的抑制作用；同时添加2种发酵液对洋葱遭受的铜胁迫没有任何缓解作用.

图1 不同处理组中洋葱的根长Fig.1 Root length of Allium cepa L.in different treatment groups

2.2 不同处理下洋葱根系的相对电导率

相对电导率是反映植物膜系统状况的一个重要生理生化指标，植物在受到逆境或者其他损伤的情况下细胞膜容易破裂，造成胞质的胞液外渗，从而相对电导率增大[26].不同发酵液对铜胁迫下洋葱根的相对电导率的影响如图2所示.

图2 不同处理组中洋葱根系的相对电导率Fig.2 Relative conductivity of Allium cepa L.root in different treatment groups

由图2可以看出，未施加铜胁迫之前，洋葱根系的相对电导率处于较低水平，培养液中添加解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液能够进一步降低根系的相对电导率，二者的作用效果同对照组相比差异不大.同时添加2种发酵液时，洋葱根系的相对电导率小幅度增加.施加铜胁迫后，洋葱根系的相对电导率大幅度增加，培养液中单独添加解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液能够显著降低根系的相对电导率，尤其是枯草芽孢杆菌作用效果显著.同时添加2种发酵液则会使洋葱根系的相对电导率略增加.未施加铜胁迫的4个处理组中，洋葱根系的相对电导率随着培养时间的延长呈现先增加后降低的趋势，在处理5 d后达到最大值；而施加铜胁迫的4个处理组中，相对电导率则随时间呈先降低后增加的趋势，在处理5 d后达到最小值.

2.3 不同处理下洋葱根系的丙二醛含量

MDA是生物膜系统脂质过氧化的产物之一，其浓度高低可用来表示脂质过氧化强度和膜系统的受伤害程度，是一种重要的逆境生理指标[27].图3显示了洋葱经过铜及发酵液处理后根系中MDA含量的变化.

图3 不同处理组中洋葱根系的丙二醛含量Fig.3 MDA content of Allium cepa L.root in different treatment groups

由图3可以看出，未施加铜胁迫的4个处理组中，洋葱根系的MDA含量处于较低水平，CK、CK+HM、CK+BS组的MDA含量相近，CK+HM+BS组在培养后期的MDA含量略有增加.施加铜胁迫后，洋葱根中的MDA含量急剧增加.向含有CuSO4·5H2O的培养液中添加解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液后，在培养初期和中期，洋葱根中的MDA含量显著降低，后期解淀粉芽孢杆菌的作用效果则不显著.2种细菌相比，枯草芽孢杆菌对洋葱根系MDA的抑制效果更好，但同时添加2种细菌发酵液对铜胁迫造成的洋葱根中MDA的生成非但没有抑制效果，反而会使MDA含量小幅增加.

2.4 不同处理下洋葱根尖细胞的有丝分裂

8个处理组中，洋葱根尖细胞的有丝分裂指数随时间的变化如表1所示.

表1 不同处理组中洋葱根尖细胞的有丝分裂指数Tab.1 Mitosis index of chromosome of Allium cepa L.root tip cells in different treatment groups %

由表1可以看出，未施加铜胁迫的4个处理组中，CK、CK+HM、CK+BS组中洋葱根尖细胞的有丝分裂指数在整个观测期内都相近（P＞0.05），同时施加2种细菌发酵液时，细胞有丝分裂指数下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）.对洋葱施加铜胁迫后，根尖细胞的有丝分裂指数大幅度下降，未添加细菌发酵液的铜处理组中，洋葱培养24 h后，细胞有丝分裂指数同对照组相比降低了86.47%.添加解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液后，洋葱根尖细胞的有丝分裂指数增加，尤其是枯草芽孢杆菌对细胞有丝分裂指数的增加效果更显著.当向铜胁迫处理组中同时添加2种细菌发酵液时，洋葱根尖细胞的有丝分裂指数降低.

2.5 不同处理下洋葱根尖细胞有丝分裂的染色体畸变率

8个处理组中，洋葱根尖细胞有丝分裂的染色体畸变情况如表2所示.

表2 不同处理组中洋葱根尖细胞染色体的畸变率Tab.2 Aberration rate of chromosome of Allium cepa L.root tip cells in different treatment groups %

由表2可以看出，在观测期内，对照组中洋葱根尖细胞染色体的畸变率始终最低.未施加铜胁迫的CK+HM和CK+BS组中染色体的畸变率与对照组相近，也比较低；同时添加了2种细菌发酵液的CK+HM+BS组中，染色体的畸变率显著增加（P<0.05）.施加了铜胁迫后，洋葱根尖细胞染色体的畸变率大幅度增加，如培养24 h后的畸变率比对照组增加了273.24%.培养液中添加了解淀粉芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液后，染色体畸变率显著降低，尤其是枯草芽孢杆菌的作用效果更显著.同时添加2种细菌时，畸变率与单纯的铜胁迫处理组相近.

2.6 铜胁迫下洋葱根尖染色体的畸变类型

洋葱根尖染色体的正常和畸变类型如图4所示.绝大多数根尖细胞的有丝分裂过程是正常的，并且可以形成2个子细胞，前期（Mitosis prophase）、中期（Mitosis metaphase）、后期（Mitosis telophase）如图 4（a）～4（c）所示.不同浓度的硫酸铜溶液处理会诱导洋葱根尖细胞出现染色体畸变现象，畸变类型如图 4（d）～4（g）所示，主要有染色体粘连（Chromosome stickness）、染色体滞后（Chromosome lagging）、染色体断片（Chromosome fragment）、染色体桥（Chromosome bridge）等.

图4 根尖细胞染色体正常有丝分裂与畸变类型Fig.4 Normal mitosis and aberration types of chromosome of root tip cells

3 讨论与结论

铜是具有双重性的重金属元素，土壤中的铜在一定浓度范围内对植物有益，过量则会对植物产生毒害作用[28-29].本研究对洋葱施加铜胁迫后，测试枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌对洋葱遭受铜胁迫的缓解作用.结果表明，洋葱在遭受铜胁迫后，根系生长受到严重影响，相对电导率和丙二醛含量显著增加.培养液中添加了枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌时，能够在一定程度上缓解洋葱根系遭受的铜胁迫，但二者叠加则未产生缓解作用.

植物生长发育依赖于细胞的有丝分裂[30]，根尖细胞有丝分裂指数作为表示体细胞繁殖活动程度的指数[31]，代表着根尖分裂细胞数占分生区细胞总数的比例，其值越高，意味着处于分裂期的细胞越多，单位时间内形成的子细胞越多，植物生长越旺盛，反之则生长不良[32].铜对洋葱根尖细胞有丝分裂造成的影响，可以通过细胞有丝分裂指数和染色体畸变现象反映出来.本研究用40 μmol/L的CuSO4·5H2O溶液处理洋葱幼苗，根尖细胞的有丝分裂指数显著降低，畸变率增加.枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌均能够缓解洋葱根尖细胞有丝分裂的异常，枯草芽孢杆菌的作用效果更显著，但2种细菌的联合使用则没有缓解效果，具体原因有待于进一步研究.铜胁迫作用下，洋葱根尖染色体细胞中出现染色体桥、染色体滞后、染色体粘连、染色体断片等畸变现象，可能途径为：①铜直接作用于带负电的DNA分子，造成断裂损伤；②铜干扰了蛋白质合成或转录，使得与染色体运动、DNA合成有关的物质不能形成；③铜通过干扰某些损伤的正常修复过程，阻止染色体在正常条件下的重建[33-34].