白茶体外抗氧化与体内抗衰老作用的研究

曾琪，任发政,2，雷新根,3，侯彩云,2*

1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083；2. 中国农业大学食品科学与营养工程学院食品质量安全北京实验室，北京 100083；3. 美国康奈尔大学动物科学系，纽约 14853

白茶为中国特有，是以特定茶树品种的鲜叶为原料，经萎凋、干燥等生产工艺制成的产品[1]，被视为中国茶类中的特殊珍品[2]。它的加工方式与其他茶类不同，是六大茶类中加工工序最为简单的茶类，因其制法不揉不炒，既不破坏酶的活性，也不促进酶促氧化，因此白茶被认为是原始、自然健康的茶[3]。现市售白茶依据茶鲜叶采摘标准不同，主要分为芽型茶白毫银针、芽叶型茶白牡丹及贡眉和多叶型茶寿眉3个等级。

近年，白茶因独特的滋味和良好的保健功效越来越受到人们的关注。“2012北京国际茶叶展”发布了关于白茶保健养生功效的研究成果[4]，结果显示白茶具有显著的抗衰老、保护肝脏等保健养生功效。目前，关于白茶的科学研究主要集中在理化成分分析[5]、抗菌[6]、抗突变[7]、抗癌[8]、预防肥胖[9]和体外抗氧化[10]等领域，而同时对白茶体外抗氧化和体内抗衰老的研究还较少。因采摘标准的不同，不同种类白茶之间的化学成分有较大的差异，生物活性也有所不同。本研究选取不同原料来源的3种白茶——白毫银针、白牡丹和寿眉为原料制备茶叶提取物，综合测定其体外抗氧化活性和体内抗衰老作用，旨在研究不同白茶提取物的抗氧化和抗衰老活性的差异，探究其作用机制，以期为白茶促进人类健康，延缓人体衰老的保健功效提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与试验动物

2016年白毫银针（Baihaoyinzhen, YZ）、2016年白牡丹（Baimudan, MD）、2016年寿眉（Shoumei, SM），购自北京马连道茶城，制于福建福鼎。

DPPH（美国 Sigma公司），GSH-Px试剂盒、SOD试剂盒、T-AOC试剂盒、MDA试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），异丙醇、氯仿、无水乙醇（分析纯）（北京化工），DEPC水（北京索莱宝科技有限公司），L-抗环血酸（国药集团化学试剂有限公司），D-半乳糖（北京酷来博科技有限公司），Trizol试剂（碧云天生物技术研究所），5X All-In-One RT MasterMix试剂盒、EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye试剂盒（美国abm公司），引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

6～7周龄 SPF级雄性 ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量(33±3) g，许可证号SCXK（京）2016-0011。小鼠饲养于屏障环境动物房：温度(22±2)℃、湿度(50±5)%、压差20～50 Pa、12 h昼夜交替进行实验。统一饲喂 SPF级小鼠生长繁殖的饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，许可证号京饲证(2014)06054。

1.2 仪器与设备

万能粉碎机，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，SHZ-III循环水真空泵，RE-52AA真空旋转蒸发仪，真空冷冻干燥机，Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白检测仪，Nikon Eclipse Ci光学显微镜，Biometra T-personal梯度PCR仪，Roche lightcycler 96荧光定量PCR仪，Eppendorf 54180R低温超速离心机，LX-200掌式离心机，FA2004分析天平，TU-1810紫外可见分光光度计等。

1.3 方法

1.3.1 白茶提取物制备与理化成分测定

将3种白茶分别均匀混合后，用万能粉碎机将少量试样磨碎过40目筛备用。参考保健食品功能学评价程序与检验方法规范中对动物实验受试物的制备方法[11]，按照 1∶15茶水比，80～90℃水浴浸提1 h，过滤并重复上述操作1次，合并茶汤进行旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥48 h得到白茶提取物。

分别采用福林酚法[12]测定茶多酚含量，三氯化铝比色法[13]测定总黄酮含量，紫外分光光度法[14]测定咖啡碱含量。

1.3.2 体外抗氧化活性测定

DPPH自由基清除法：参照 Ramadan[15]方法并稍加修改，配制 0.2 mmol·L-1的 DPPH无水乙醇溶液，于4℃下避光保存备用，按表1所示，将各管混匀，于室温黑暗处放置 30 min，在517 nm的波长下测定吸光值。DPPH清除率的计算公式：

式中：A样品为样品管吸光度；A空白为空白管吸光度；A对照为对照管吸光度。

表1 DPPH法加样表Table 1 The method of DPPH addition mL

T-AOC试剂盒法：按照试剂盒说明书的简便操作表，配制混合试剂，分别对各白茶提取物的总抗氧化能力进行测定。

1.3.3 动物实验设计

白茶剂量设计：茶叶的人体每日推荐剂量为0.15 g·kg-1[16]，参照保健食品功能学评价程序与检验方法规范，选择人体推荐量的10倍、30倍为小鼠的低、高白茶摄入剂量，即分别为 1.5、4.5 g·kg-1·d-1。

实验动物分组：90只小鼠按体重随机分为 9组，每组 10只，分别为：正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、阳性对照组（PC）、白毫银针提取物高剂量干预组（YZH）、白毫银针提取物低剂量干预组（YZL）、白牡丹提取物高剂量干预组（MDH）、白牡丹提取物低剂量干预组（MDL）、寿眉提取物高剂量干预组（SMH）、寿眉提取物低剂量干预组（SML）。除 NC组小鼠皮下注射等体积生理盐水外，其他各组皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1；造模同时给予灌胃干预，NC和MC组灌胃等体积蒸馏水，PC 组灌胃 100 mg·kg-1·d-1等体积 VC，其余组别小鼠灌胃白茶原茶对应等量的白茶提取物，持续处理56 d。

1.3.4 样本采集及处理

实验结束后所有小鼠禁食12 h，摘眼球取血，断颈法快速处死。所得血样于3 500 r·min-1离心15 min，分离血清样本；切取一叶肝脏迅速冻存于-80℃以待下一步的生化检测，切取另一叶肝脏暂存于组织固定液中，用于组织病理学观察。

1.3.5 生化指标的检测

血清中谷丙转氨酶（Alanine transferase，ALT）和谷草转氨酶（Aspartate transaminase，AST）水平利用全自动生化分析仪测定；血清和肝组织的SOD、GSH-Px活性、T-AOC水平和MDA含量按照试剂盒说明书方法测定。

1.3.6 组织病理学观察

从组织固定液中取出肝组织，脱水，石蜡包埋，制片（4 μm厚），HE染色，光学显微镜观察并在200倍视野下拍照。

1.3.7 实时荧光定量PCR检测

Trizol试剂抽提小鼠肝脏RNA，检测RNA浓度及质量，反转录制备cDNA第一链，荧光定量采用 10 μL体系，EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye 5 μL，cDNA 模板 1 μL，上游引物（10 nmol·L-1）0.3 μL，下游引物（10 nmol·L-1） 0.3 μL，ddH2O 补充至 10 μL。按照梯度程序：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，60 s，循环35次。以GAPDH为内参基因，采用法[17]对各抗衰老相关基因的表达水平进行分析。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、核因子 E2-相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和 Klotho基因引物由上海生工合成，其序列如表2所示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，以均值±标准误差表示；组间均值比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 白茶提取物的主要功效成分

3种白茶提取物中茶多酚、总黄酮和咖啡碱含量如表3所示。从表中可以看出，YZ提取物的茶多酚含量极显著高于MD和SM提取物（P＜0.01），YZ和 SM 提取物的总黄酮含量极显著高于 MD提取物（P＜0.01），YZ和MD提取物的咖啡碱含量极显著高于SM提取物（P＜0.01）。YZ提取物的3种主要功效成分含量均为最高，SM提取物的茶多酚和总黄酮含量均高于MD提取物。

茶多酚是影响茶叶滋味、色泽的重要品质成分，是茶叶中多酚类化合物的统称，以儿茶素含量居多[18]，儿茶素具有很强的抗氧化活性，可以清除机体内的自由基，是一种天然抗氧化剂[19]。此外，茶叶中的黄酮类化合物也具有很强的清除自由基能力，抗氧化效果良好[20]。有研究表明，白茶中的黄酮类物质高于其他茶类[21]，可能与其鲜叶种类和加工方式有关。咖啡碱是茶叶中苦味的主要呈味物质，除具有强心、兴奋、利尿等药理功效外，还具有抗癌的作用[22]，是茶叶中重要的生物活性物质之一，可能与茶叶中其他生物活性成分存在协同作用，起到间接抗氧化的作用。

表3 白茶提取物的主要功效成分Table 3 The main efficacy components of white tea extracts mg·g-1

2.2 白茶提取物的体外抗氧化活性

如图1-A所示，3种白茶提取物对DPPH自由基清除率随着浓度的增加而升高，当质量浓度为 40 μg·mL-1时，YZ提取物对 DPPH自由基的清除率超过90%，MD和SM提取物均超过85%。3种白茶提取物均表现出较强清除DPPH自由基的能力，其中，YZ提取物最强，MD与SM提取物差异不明显。

AOC是评价物质总抗氧化能力的重要指标，其T-AOC水平越高，抗氧化能力越强。图1-B显示，3种白茶提取物的T-AOC水平随浓度的增加而升高。当提取物质量浓度为40 μg·mL-1时，YZ提取物、MD提取物和 SM 提取物的T-AOC水平分别为2.68、2.25、2.15 U·mL-1。

结合表3可知，3种功效成分含量均较高的YZ提取物，清除DPPH自由基的能力和总抗氧化能力也较强。SM提取物的茶多酚和总黄酮含量高于 MD提取物，咖啡碱含量低于MD提取物。茶多酚和总黄酮具有较强的抗氧化作用，SM和MD提取物之间的体外抗氧化活性差异却不明显。由此可见，茶叶中的生物活性成分在起抗氧化作用时存在协同作用。

2.3 白茶提取物的体内抗衰老作用

2.3.1 对小鼠血清SOD、GSH-Px活性、T-AOC水平和MDA含量的影响

如表4所示，MC组小鼠的血清中的SOD、GSH-Px活性和 T-AOC水平显著低于 NC组（P＜0.05），MDA 浓度显著高于 NC组（P＜0.05），由此可见，D-半乳糖致小鼠衰老模型制备成功。各白茶提取物组小鼠血清的SOD活性均高于MC组，其中YZL组、MDH组、SMH组显著高于MC组（P＜0.05），SML组极显著高于 MC组（P＜0.01）。YZH组、YZL组、MDH组、MDL组和SMH组小鼠血清的GSH-Px活性也均高于 MC组。SOD和GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，其活力的提高可间接反映机体清除自由基能力的增强，削弱对脂质过氧化作用的损伤，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[23]。各白茶提取物组小鼠血清SOD和GSH-Px活性的提高，表明各白茶提取物通过提高小鼠的抗氧化酶活性进而达到清除体内自由基，缓解机体氧化应激水平的作用。

图1 白茶提取物的体外抗氧化活性Fig. 1 The in vitro antioxidant activities of white tea extracts

通过持续给小鼠注射一定剂量D-半乳糖，使细胞内半乳糖浓度增高，生成半乳糖醇不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀和功能障碍；另外，D-半乳糖受半乳糖合成酶的作用，代谢过程中产生过多自由基，最终引起衰老[24]。白茶提取物通过提高小鼠血清 T-AOC水平来抑制衰老的发生，其中YZH组、MDH组、SMH组和SML组极显著高于MC组（P＜0.01）。研究表明，MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物[25]，其浓度的变化可间接反映组织中氧自由基浓度的变化量，是常用的膜脂过氧化指标。各白茶提取物组小鼠血清MDA含量均显著低于MC组（P＜0.05），由此可见，白茶提取物通过提高血清总抗氧化能力，降低脂质过氧化程度来保护机体免受氧化损伤，延缓衰老的发生。

实验结果表明，3种白茶提取物均可一定程度缓解衰老小鼠的氧化应激水平，并且未表现出剂量依赖性。其中，SM提取物在提高小鼠血清SOD活性和T-AOC水平方面比YZ和MD提取物更具优势。

2.3.2 对小鼠肝脏SOD、GSH-Px活性、T-AOC水平和MDA含量的影响

表5显示，MC组小鼠肝脏MDA含量极显著高于NC组（P＜0.01），表明造模使小鼠肝脏发生严重的脂质过氧化，使小鼠肝脏的总抗氧化能力下降。除YZH组外，各白茶提取物组小鼠肝脏SOD和GSH-Px活性均显著高于 MC组（分别为P＜0.01，P＜0.05）。SOD和GSH-Px是肝脏中重要的抗氧化酶，能够有效清除超氧阴离子自由基[26]、特异性地催化谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应[27]。各白茶提取物组小鼠肝脏T-AOC水平也均高于MC组，其中YZH组、YZL组、MDH组、MDL组、SMH组和SML组分别比MC组小鼠高出50%、89%、64%、64%、103%和61%，SMH组效果更为明显。由此可见，3种白茶提取物均可提高衰老小鼠肝脏抗氧化酶的活性和总抗氧化能力，缓解衰老小鼠肝脏的氧化应激状态。

小鼠肝脏MDA含量越高，表明小鼠肝脏脂质过氧化程度越严重。YZ和 SM提取物均可降低衰老小鼠肝脏MDA含量，其中YZH组和 SMH组小鼠 MDA含量显著低于 MC组（P＜0.05），YZL组极显著低于MC组（P＜0.01），表明YZ和SM提取物在降低小鼠肝脏脂质过氧化程度方面较MD提取物更具优势。

表4 白茶提取物对小鼠血清SOD、GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC的影响Table 4 Effect of white tea extracts on the activities of SOD, GSH-Px and the contents of MDA and T-AOC in serum of mice

表5 白茶提取物对小鼠肝脏SOD、GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC的影响Table 5 Effect of white tea extracts on the activities of SOD, GSH-Px and the contents of MDA and T-AOC in liver of mice

综上可知，3种白茶提取物均可显著提高衰老小鼠肝脏抗氧化酶的活性（P＜0.05），能够一定程度提高其总抗氧化能力，并且未表现出剂量依赖性。其中YZ提取物在降低衰老小鼠肝脏脂质过氧化方面表现出明显优势，SM提取物效果次之，MD提取物效果相对较弱。

2.3.3 对小鼠肝组织相关基因表达的影响

肝脏SOD和GSH-Px的正常表达能控制机体内自由基保持在较低水平，有利于机体健康。由图2-A可知，与NC组小鼠相比，YZH组、MDH组和SMH组小鼠肝脏SOD表达分别提高了17%、64%和16%。与MC组小鼠相比，YZH组、YZL组、MDH组、MDL组、SMH组和SML组小鼠肝脏SOD表达量分别提高了252%、214%、385%、220%、248%和155%。其中，MDH组小鼠肝脏SOD的表达量显著高于MC组（P＜0.05）。由图2-B可知，与MC组小鼠相比，YZH组、YZL组、MDH组、MDL组、SMH组和 SML组小鼠肝脏GSH-Px表达量分别提高了 306%、210%、372%、248%、361%和 297%。结果显示，3种白茶提取物均能上调衰老小鼠肝脏SOD和GSH-Px的表达量，并且表现出剂量依赖性，可通过上调抗氧化酶基因的表达来缓解机体氧化应激水平以抵抗机体衰老。

图2 白茶提取物对小鼠肝脏SOD、GSH-Px、Nrf2和Klotho基因表达的影响Fig. 2 Effects of white tea extracts on the expression levels of SOD, GSH-Px, Nrf2, and Klotho genes in mice liver

Nrf2是抗氧化信号通路中关键的转录因子，当机体处于氧化应激状态时，它会上调多种抗氧化酶基因的表达进而提升机体的抗氧化能力，缓解机体氧化应激，延缓衰老的发生[28]。由图2-C可知，各白茶提取物组小鼠肝脏Nrf2的表达与提取物剂量呈现出剂量依赖关系。与MC组小鼠相比，YZH组、YZL组、MDH组、MDL组和SMH组小鼠肝脏Nrf2的表达均显著提高（P＜0.05），SML组也提高了17%。与 NC组小鼠相比，YZH组小鼠肝脏Nrf2的表达也显著提高（P＜0.05）。由此可见，YZ提取物在提高衰老小鼠肝脏Nrf2的表达方面具有明显优势。

Klotho基因被称为抗衰老基因，是哺乳动物体内第一个过表达延长生命、低表达加速衰老的衰老抑制基因，在抗衰老及衰老相关疾病的发生中发挥着极为重要的作用[29]。由图2-D可知，各白茶提取物组小鼠肝脏Klotho表达与MC组和NC组没有显著性差异（P＞0.05）。但与MC组小鼠相比，YZH组、YZL组、MDH组、MDL组、SMH组和 SML组小鼠肝脏Klotho表达分别提高了36%、54%、54%、40%、114%和49%。结果表明，YZ、MD和SM提取物均可在一定程度上提高衰老小鼠肝脏Klotho的表达，以延缓机体衰老。

2.4 白茶提取物的安全性评价

2.4.1 白茶提取物对小鼠肝组织形态的影响

图3为各组小鼠肝脏病理学切片的 H&E染色结果，NC组小鼠肝细胞大小均匀，排列整齐，肝窦清晰，肝索排列整齐有序，细胞核清晰可见，胞浆均匀。与NC组小鼠肝脏切片相比，MC组小鼠肝脏组织出现了可见出血性坏死，中央静脉周围肝细胞胞浆疏松，肝窦内实质细胞增多等现象。由此可见，造模对MC组小鼠肝脏组织结构造成了一定程度的损伤。

图3 小鼠肝脏组织切片Fig. 3 Liver tissue slice in mice

此外，其余各白茶提取物组小鼠也出现了不同程度的肝细胞肿胀、胞浆疏松和胞浆淡染等现象，但较MC组小鼠而言，各白茶提取物组小鼠肝组织损伤情况有了一定程度的减轻，但不能抑制肝脏结构的损伤，结合表6可知，各组小鼠血清肝酶与 NC组无显著性差异（P＞0.05）。由此表明，在该实验设置剂量下的白茶提取物对小鼠肝脏起到了一定程度的保护作用，并且未表现出肝毒性作用。

2.4.2 白茶提取物对小鼠血清肝酶水平的影响

血液中ALT和AST水平是评价肝脏功能正常与否的重要指标之一，也是肝细胞受损的重要指标之一[30]，由表6可知，MC组与NC组小鼠血清 ALT和 AST水平无显著性差异（P＞0.05），表明注射D-半乳糖制备衰老小鼠模型未对小鼠肝脏造成功能性损伤。

各白茶提取物组小鼠血清ALT和AST水平与NC组小鼠没有显著性差异（P＞0.05），与MC组相比，YZL组、YZH组、MDH组、MDL组和SML组小鼠血清ALT水平显著降低，YZH组和MDH组小鼠血清AST水平也显著降低（P＜0.05），表明3种白茶提取物对小鼠肝功能有一定的保护作用。由此可见，在该实验设置剂量下，3种白茶提取物对小鼠均未表现出肝毒性作用。

表6 小鼠血清ALT、AST水平Table 6 The contents of ALT and AST in serum of mice U·L-1

3 结论

本研究结果表明，3种白茶表现出良好的体外抗氧化作用。在相同浓度条件下，3种主要功效成分含量较高的白毫银针抗氧化作用明显强于白牡丹和寿眉，白牡丹与寿眉的体外抗氧化作用差别不明显。在本实验设置灌胃剂量下，不同白茶在机体内发挥抗衰老作用的方式各有侧重，白毫银针在抑制小鼠肝脏脂质过氧化方面具有明显优势，寿眉在提高小鼠血清抗氧化酶活性方面具有明显优势。3种白茶均能上调小鼠肝组织SOD、GSH-Px、Nrf2和Klotho的表达，并表现出剂量依赖性，能有效改善机体氧化应激状态，拮抗机体衰老。综合体外抗氧化与体内抗衰老结果，本研究所选白毫银针的效果优于寿眉，白牡丹的效果相对较弱。

机体衰老是一个复杂的生理过程，体外抗氧化能力越强并不意味着体内抗衰老作用越好，而茶叶的抗衰老作用也受多种因素综合影响，不同物质对机体抗衰老调控方式有所不同，对于茶叶体内抗衰老作用机制还有待进一步研究。