电针对肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤的影响

练 毅，余剑波，宫丽荣，李 静，张 志，张 圆，阚永星

肢体缺血再灌注是严重肢体挤压伤及肢体手术不可避免的病理生理过程，其诱发的炎性介质的大量释放、氧化应激等可引起远隔脏器损伤，肺脏是最易受累的脏器[1-2]。电针刺具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等作用，对急性肺损伤有保护作用[3-4]。但电针刺对肢体缺血再灌注诱发肺损伤的影响及机制并不明确。本文探讨电针肺俞穴和足三里穴对肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 健康清洁级新西兰大白兔40只，雄性，体质量1.8～2.3 kg，3月龄，天津市中西医结合急腹症研究所实验动物中心提供。戊巴比妥纳(百奥莱博公司)，内毒素(LPS，Sigma公司，美国)，G6805-1A低频电子脉冲治疗仪(上海华谊医用仪器有限公司)，Premier 3000型动脉血气分析仪 (GEM公司)，髓过氧化物酶(MPO)试剂盒 (南京建成)，细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)兔多克隆抗体、核因子-κBp65 (NF-κBp65)兔多克隆抗体(Abcam公司，美国)，β-actin一抗、DAB显色试盒 (Santa Cruz公司，美国)，山羊抗兔IgG二抗 (北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.2 分组和模型制作 根据预实验选取40只新西兰大白兔采用随机数字表编号随机分为假手术组、模型组、电针组和非穴位电针组（每组n=10）。参照文献[5]的方法制作肢体缺血再灌注损伤模型。实验前禁食8 h，不禁饮。1%戊巴比妥纳30 mg/kg腹腔注射麻醉。仰卧位固定于兔台上，右颈内静脉穿刺置管以备输液，备皮，于兔双后肢股动脉三角区消毒皮肤并切开，分离出股静脉、股动脉，以微型动脉夹于近腹股沟韧带处夹闭股动脉3 h形成缺血期，随后松开无创微动脉夹，再灌注4 h形成再灌注期，假手术组只放置微型动脉夹而不夹闭股动脉。实验期间静脉输注生理盐水1.5 mL·kg-1·h-1。

1.3 电针刺预处理 参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”选取兔双侧肺俞穴(足太阳膀胱经穴，位于背部，第3胸椎棘突下旁开约1.5 cm处) 和足三里(足阳明胃经穴，位于后肢背外侧，胫骨粗隆下部外约0.3 cm处)，采用特殊兔盒暴露针刺部位，消毒后采用直径0.3 mm一次性无菌针灸针，直刺进针约5～7 mm接电针，采用G6805-1A低频电子脉冲治疗仪进行刺激。针刺参数为：疏密波，刺激电流l～2 mA，频率2/15 Hz，波宽0.2～0.6 ms，以兔出现轻微肌颤为宜，每次持续30 min，1次/d。电针组于模型制备前1～4 d及模型制备过程中行电针刺激，非穴位电针组以相同参数针刺足三里及肺俞穴旁开0.5 cm非经非穴处。

1.4 标本采集 实验结束时采用颈总动脉放血法处死兔，留取双肺组织，取右肺组织测定W/D比值，取部分左肺组织用4%多聚甲醛固定，取部分左肺组织在液氮内经速冻处理后于-80 ℃冰箱保存。

1.5 肺组织W/D比值的测定 取右肺上叶组织100 mg，纱布拭去水渍，置于精细天平上称湿重(W)，然后置于80 ℃电热恒温干燥箱烘干48 h至恒重后称干重(D)，计算肺组织W/D比值。

1.6 肺损伤评分 左肺上叶组织置于4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋连续切片，HE染色，封片，在光学显微镜下观察病理学结果，参照文献[6]的方法进行肺损伤评分。评分项目包括肺泡水肿、肺间质水肿、炎性细胞浸润及肺泡出血4项，各项按严重程度进行评分，无改变或非常轻微改变为0分，轻度、中度、重度、极重度改变依次为1分、2分、3分、4分，各项评分之和即定为肺组织病理学损伤评分。

1.7 邻联茴香胺比色法测定肺组织MPO活性 取右肺中叶组织，制成10%组织匀浆，按试剂盒说明书进行操作。

1.8 Western blotting法检测 NF-κBp65、ICAM-1蛋白表达 取-80 ℃冻存肺组织，冻融、剪碎后10000 g 离心20 min，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取样品20 µg蛋白行SDS-PAGE凝胶恒压电泳、转膜、封闭1 h后，加入一抗(1：1000)4 ℃孵育过夜，TBST清洗5次，每次5 min，加入山羊抗兔IgG二抗 (1：3000)室温孵育1 h后漂洗。TBST漂洗后，于暗室中进行显色和曝光，采用Quantity One图像分析软件进行分析，以目的蛋白与内参β-actin条带积分光密度值的比值反映NF-κBp65、ICAM-1蛋白表达水平。

1.9 统计学处理采用 SPSS 19.0软件进行分析，所有数据以均数±标准差表示，通过Ryan-Joiner法行正态性检验，采用双侧检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。选取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量的变化 电针刺预处理前、肢体缺血再灌注损伤模型建立前各组新西兰大白兔体质量比较无显著差异(P＞0.05，见表1）。电针组及非穴位电针组的肺损伤评分明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)，电针组的肺损伤评分明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组兔体质量的比较(n=10,)

表1 各组兔体质量的比较(n=10,)

组别 电针刺预处理前(kg) 肢体缺血再灌注损伤模型建立前(kg)假手术组模型组电针组非穴位电针组2.09±0.19 2.05±0.21 2.10±0.17 2.08±0.20 2.08±0.18 2.05±0.23 2.09±0.20 2.07±0.21

2.4 肺组织MPO活性变化测定 结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及非穴位电针组的MPO活性明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)，电针组的MPO活性明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.2 肺组织W/D比值的变化 测定结果显示（见表2）：灌注4 h时，模型组、电针组及非穴位电针组的肺组织W/D比值明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)，电针组的肺组织W/D比值明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 肺组织病理学变化 检测结果显示（见图1，表2）：灌注4 h时， 假手术组兔肺组织未见明显病理改变，模型组及非穴位电针组可见肺泡及间质广泛水肿、炎细胞浸润、可见出血，电针组水肿、炎细胞浸润和出血均较模型组减轻。模型组、

表2 各组兔肺损伤评分、W/D比值及MPO活性的比较(n=10,)

表2 各组兔肺损伤评分、W/D比值及MPO活性的比较(n=10,)

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 肺损伤评分(分) W/D比值 MPO活性(U/g)假手术组模型组电针组非穴位电针组0.87±0.29 8.12±1.05a 4.38±0.64a、b 8.23±0.98a 3.09±0.15 6.75±0.36a 4.90±0.23a、b 6.68±0.39a 1.59±0.25 5.18±0.45a 3.76±0.33a、b 5.24±0.39a

2.5 NF-κBp65蛋白变化 Western blotting结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及非穴位电针组的NF-κBp65蛋白表达明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)，电针组的NF-κBp65蛋白表达明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 2。

2.6 ICAM-1蛋白变化 Western blotting结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及非穴位电针组的ICAM-1蛋白表达明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)，电针组的ICAM-1蛋白表达明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

3 讨论

肢体缺血再灌注引起远隔肺损伤发病机制复杂, 其主要病理学特征是中性粒细胞(polymorphonuclear, PMN)在肺组织大量聚集及肺微血管通透性增高所致的肺水肿[7]。PMN在肺内的聚集是由位于PMN和肺微血管内皮细胞表面的一系列黏附分子如ICAM-1、 CD44等表达上调所介导的[8]，所以抑制肢体缺血再灌注的黏附分子表达上调是抑制PMN聚集的重要策略。MPO为PMN的特征酶，组织MPO活性的高低可以反映PMN在组织中的聚集程度[9]。肺组织W/D则可反映肺微血管通透性改变的程度。

图1 各组兔肺组织病理表现 (HE ×100)

图2 各组NF-κBp65蛋白表达的变化

图3 各组ICAM-1蛋白表达的变化

NF-κB是调控炎症因子表达的诱导型核转录因子，其亚基p65与p50通常以二聚体的形式与抑制蛋白IκB (Inhibitor of kappa B)结合而呈无活性状态，当细胞受到氧化损伤等外源性刺激后，通过信号传导引起IκB降解，导致NF-κBIκB复合物解体，NF-κB移位至细胞核被激活，暴露的p65蛋白与核内κB基因特异序列相结合并启动转录，介导诸多炎症介质如ICAM-1、TNF-a等过度表达，进而引起PMN黏附聚集，导致组织细胞级联放大的炎症损伤反应[10-11]。

电针刺激具有双向调节作用，可通过减少炎性介质释放、氧自由基产生等对脏器起免疫调节和保护作用[12-13]。研究表明，足三里穴可抑制炎性介质的释放[14]；肺俞穴是足太阳膀胱经的重要穴位，是针灸调节肺脏功能的常用穴位。我们前期相关研究表明，电针刺足三里和肺俞穴位能够减轻兔内毒素休克所致的急性肺损伤，其机制可能与其抗氧化、抗炎症反应的作用有关[3,15]。

本研究显示，再灌注4 h时肺组织W/D比值、MPO及肺损伤评分增高，说明肺功能受损，而给予电刺激肺俞穴和足三里穴组较模型组W/D比值、MPO及肺损伤评分降低，提示电刺激肺俞穴和足三里穴可减轻肢体缺血-再灌注肺损伤。再灌注4 h时ICAM-1及NF-κBp65表达水平升高；而给予电刺激肺俞穴和足三里穴组较模型组ICAM-1及NF-κBp65表达水平降低，提示电刺激肺俞穴和足三里穴可抑制肺组织NF-κB表达，进而下调ICAM-1的表达。综合研究结果，可能提示电刺激肺俞穴和足三里穴可通过抑制肺组织NF-κB激活，从而减少ICAM-1介导的中性粒细胞聚集，减轻肢体缺血再灌注诱发的兔肺损，其它可能涉及的机制待研究。