余甘果抑菌作用及辅助乙醛降解特性的研究

张大为，张 洁，闫 佳，田永航，裴志胜

（海南热带海洋学院生命科学与生态学院，海南省海洋食品工程技术研究中心，海南三亚572022）

余甘果又名“油甘”“望果”“余甘子”“牛甘果”等，是大戟科叶下珠属落叶小乔木或灌木。后味甘甜，微酸，具有保肝护肝、抗衰老、健胃消食等功能。它不仅具有很高的营养价值，而且还有药用价值，并被载入《中华人民共和国药典》[1]。余甘果原产于印度、印度尼西亚等国，早在2000多年前我国就有种植，并被广泛认知。余甘果树主要生长在福建南部、广东、广西、云南、台湾等地区，其中福建南部及广西分布较多。余甘果是一种生命力极顽强的植物，其果实可以在常温下放置一个多月仍保持不腐烂[2]。

余甘果的营养极为丰富，果实中含有较高的维生素C、维生素B、蛋白质、果酸、脂肪酸、十几种微量元素和十几种氨基酸[3]等。余甘果本身具有的价值已经引起全世界人民的高度重视。余甘果在我国南方广为流传，据《本草纲目》中记载，“久服余甘汁，可以轻身，延年长生”。市场上也出现了各式各样的余甘果产品，其中余甘果蜜饯最为流行，不仅口感好，而且价格也合理，具有很好的开发前景[4-6]。余甘果有较高的药用价值，不仅具有抗衰老作用，而且有健胃消食、抗菌消炎、生津止咳、有效止泻、减缓恶心和治疗月经失调等功能。“余甘卤”在我国民间依然是家中常备的药品，它是以余甘果加部分甘草浸泡在盐水中制成的，常用于治疗消化不良、痛经、风寒、厌食、肚痛腹泻和恶心呕吐等常见的疾病[7-8]。

果酒酿造过程中，传统的抗菌剂是SO2，研究发现SO2会对人体健康产生危害，所以找到能够替代SO2的物质是亟待解决的问题[9-11]。大量研究表明，很多植物能够起到很好的抗菌作用，比如黄檗、肉桂。从植物中寻找适合于果酒酿造的天然抗菌剂已经成为可能，有望替代传统的抗菌剂[12-13]。另外，很多人在饮酒后会出现面红、恶心等症状，主要原因是乙醛所带来的影响，其伤害程度远远高于乙醇。研究发现，多种植物具有解酒护肝的功能，比如人参、葛根、巴西莓等。其作用机制是通过抑制胃肠吸收乙醇和加速代谢以降低机体血醇浓度[14-17]。鉴于余甘果所具有的特殊营养价值和药用价值，本试验着重研究余甘果对腐败菠萝酒中腐败细菌的抑制作用以及其对乙醛脱氢酶作用效果的影响，为余甘果在酿酒、解酒等方面的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

余甘果，市售。

细菌培养基：称量牛肉膏1.5 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、琼脂6.0 g，再加入清水300 mL煮沸，调节pH7.0。

试剂：乙醛（40%，分析纯），购于天津市大茂化学试剂厂；乙醛脱氢酶，sigma公司；碘、碘化钾、亚硫酸氢钠、淀粉、草酸铵、结晶紫、番红等试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：BSP-400型生化培养箱，上海新苗医疗器械有限公司；SW-CJ-2F型超净工作台，苏州苏洁净化设备厂；AUY-120型分析天平，日本岛津公司；PB-10型pH计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SZX10摄影显微镜，日本OLYMPUS。

1.2 试验方法

1.2.1 腐败菠萝酒中腐败菌的分离及初步鉴定

取少量菠萝酒放入37℃培养箱中培养，直至出现异味及表面出现大量菌膜。利用稀释平板法分离腐败菠萝酒中的腐败细菌，先对腐败酒原液进行梯度稀释，稀释倍数分别为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分别取0.1 mL上述浓度的稀释液涂平板，37℃倒置培养72 h，挑取单菌落进行分离纯化。每个梯度做3个平行实验[13]。

通过菌落形态、菌体形态、革兰氏染色等方法，对所分离的腐败细菌进行初步鉴定。

1.2.2 抑菌实验

菌悬液制备：将分离得到的腐败菌用无菌水稀释，调整其浓度为106个/mL，备用。

细菌平板制备：取9 cm的平皿，倒入10 mL的细菌固体培养基，待其凝固后通过涂布法将0.1 mL的菌悬液均匀涂布于培养基表面，静置备用。

抑菌实验：以滤纸片抑菌法为参考，对其加以改进，方法如下：制备直径为6 mm，厚度为2 mm的余甘果果肉圆片，用无菌水冲洗，去除多余水分。将余甘果片放在制备好的细菌平板上，并以直径为6 mm的无菌滤纸片作为对照。

表1 腐败菌的特征

1.2.3 乙醛测定方法

利用CH3CHO与过量的NaHSO3发生加成反应，待反应完全后，进行滴定实验，用配制好的I2标准溶液测定剩余NaHSO3的量，并同时做空白滴定实验。通过NaHSO3反应前后的变化，即I2标准溶液滴定时所消耗的体积之差，则可以计算出乙醛的含量[15]。

计算公式：

式中：V2——空白实验滴定时所消耗的I2标准溶液的体积，mL；

V1——样品滴定消耗I2标准溶液的体积，mL；

C——I2标准溶液的浓度，mol/L；

G——乙醛样品称样量，g；

22.02——乙醛化学反应基本单元，g/mol。

1.2.4 余甘果果肉辅助乙醛降解特性的研究方法

1.2.4.1 余甘果果肉对乙醛降解率的影响

取干燥的具塞试管3支，分别编号为1、2、3，在1号试管（对照组）中加入5 mL乙醛（40%），2号试管中加入5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脱氢酶，3号试管中加入5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脱氢酶和1.0 g余甘果果肉，混匀盖紧塞子，37℃放置10 h，然后测定乙醛含量。每组实验均做3组平行实验。

1.2.4.2 余甘果果肉添加量的确定实验

取干燥的具塞试管5支，分别编号为1、2、3、4、5，在所有试管中加入5 mL乙醛（40%）和0.1 g乙醛脱氢酶。1号试管作为空白对照，2、3、4、5号试管分别加入0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g余甘果果肉，混匀盖紧塞子，在37℃下放置10 h，然后测定乙醛含量。每组实验均做3组平行实验。

1.2.4.3 不同反应温度对乙醛降解率的影响

取干燥的具塞试管3支，分别编号为1、2、3，在3支试管中均加入5 mL乙醛、0.1 g乙醛脱氢酶和1.5 g余甘果果肉，分放在30℃、37℃和40℃下放置10 h，然后测定乙醛含量。每组实验均做3组平行实验。

2 结果与分析

2.1 菠萝酒中腐败菌的分离及初步鉴定结果

分离得到4种腐败菌，4种腐败细菌特征见表1和图1。

图1 4种腐败菌的显微镜图片

由图1可看出，1号和2号菌呈短杆状，3号和4号为球状，根据其菌落形态、菌体形态等特征判断，具有细菌的典型性，均为单细胞。

2.2 余甘果果肉对菠萝酒腐败菌的抑制结果

用抑菌圈法测定余甘果果肉对菠萝酒腐败细菌，对4种主要腐败细菌的抗性见图2。

如图2所示，余甘果对腐败菌1、腐败菌2和腐败菌4均有不同程度的抑制作用，从抑菌圈大小看，对腐败菌1的抑制作用最强，其次是腐败菌2，最后是腐败菌4，其平均抑菌圈直径见表2，分别是15.5 mm、12.8 mm和11.5 mm。余甘果果肉对细菌3没有抑制作用，抑菌圈直径为0 mm。将4种细菌分别用灭菌的菠萝汁培养发现，1号菌发酵液具有明显的腐臭味，应该是某种导致水果腐烂的细菌；2号菌发酵液具有明显的刺激性酸味，表面有一层薄膜，由此判断可能是某种醋酸菌；4号细菌无明显腐烂和酸的味道，但是有令人不愉快的气味。结合以上抗菌实验可以说明，余甘果对菠萝酒腐败菌具有很好的抗性。余甘果果肉对3号细菌无抑制作用，接种到菠萝汁中发酵后，发酵液具有令人愉快的香气。综上所述，可以推断余甘果在菠萝酒酿造中有潜力作为抗菌物质来使用。

图2 余甘果对4种腐败细菌的抑制结果

表2 余甘果对4种细菌的抑菌效果

2.3 余甘果果肉对乙醛降解率的影响（图3）

由图3可知，对照组是只加了5 mL的乙醛（40%），经过10 h后，降低到33.88%。乙醛+乙醛脱氢酶实验组中，由于乙醛脱氢酶作用，经10 h的反应后乙醛含量降低到18.24%，其转化率为46.16%。在乙醛+乙醛脱氢酶+余甘果果肉实验组中，由于余甘果果肉的加入，乙醛含量降为16.54%，乙醛转化率51.18%，比乙醛+乙醛脱氢酶的实验组增加5.02%。由此可以说明，余甘果对乙醛脱氢酶降解乙醛具有辅助增强的作用，可能是增强了乙醛脱氢酶的活力。

图3 余甘果对乙醛降解率的影响结果

图4 余甘果果肉不同添加量对乙醛降解率的影响

2.4 余甘果果肉添加量对乙醛降解率的影响（图4）

如图4所示，余甘果果肉添加量分别为0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g时，经过10 h的作用后，乙醛的含量呈逐渐降低的趋势，与对照组（只含有乙醛和乙醛脱氢酶）相比，乙醛含量均有不同程度的降低，说明在乙醛脱氢酶和余甘果果肉的共同作用下乙醛降解。余甘果果肉添加量为1.5 g时，乙醛含量为14.67%，其转化率为56.70%。当果肉量继续增加到2.0 g时，乙醛含量变化不大，说明添加余甘果1.5 g/5 mL 40%乙醛（即0.3 g/mL 40%乙醛）时是最恰当的。

2.5 不同温度对乙醛降解效果的影响（图5）

如图5所示，在同时添加5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脱氢酶和1.5 g余甘果果肉的情况下，分别测试不同温度下乙醛的降解效果，37℃时降解效果最好，其次是40℃，降解效果最差的是30℃，由此说明37℃是最适合酶和余甘果共同作用的温度。由于30℃是实验中较低的温度，所以相对于37℃、40℃而言挥发量减少，测定值比较高。可见，比最适温度高的温度不利于乙醛脱氢酶和余甘果果肉共同降解乙醛。

图5 不同温度对乙醛降解率的影响

3 结论

从腐败的菠萝酒中分离得到4种腐败菌，经初步鉴定为细菌，分别为1号、2号、3号和4号，余甘果果肉对1号、2号和4号细菌具有较为强烈的抑制作用，抑菌圈直径分别为15.5 mm、12.8 mm和11.5 mm，对3号细菌无抑制作用。结果表明，余甘果果肉具有抑制菠萝酒腐败的潜力。通过实验表明，余甘果能够辅助乙醛脱氢酶降解乙醛，只添加乙醛脱氢酶时，乙醛的转化率为46.16%，同等条件下添加余甘果以后，乙醛的转化率为51.18%，转化率提高了5.02%。余甘果果肉的最适添加量为1.5 g/5 mL 40%乙醛（即0.3 g/mL 40%乙醛），余甘果和乙醛脱氢酶的最适作用温度为37℃。