黄芩素对乳腺癌肝转移的影响及作用机制的体内研究

闫婉君 张淑群

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来有发病年轻及发病率上升的趋势，严重威胁着女性的身心健康，转移是晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。黄芩素是一种广泛使用的中草药，大量的研究表明黄芩素具有广谱的抗肿瘤作用。SATB1(special AT rich sequence binding protein1)是一种组织特异性核基质结合蛋白，近几年研究SATB1在大多数实体肿瘤组织中的含量都有增加,尤其在浸润性乳腺癌细胞中高表达。大量研究表明，EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition，上皮间质转化)的发生过程和Wnt/β-catenin信号通路与乳腺癌的远处转移特征有着密切的联系。本实验旨在探讨黄芩素(Baicalein)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞肝转移的影响及相关的作用机制是否与SATB1蛋白，EMT的发生以及Wnt/β-catenin信号通路有关，这将为黄芩素抗肿瘤的研究增添了新的基础理论依据，为寻找安全有效的抗癌药物提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

黄芩素购于美国sigma公司,溶于DMSO(美国 Sigma 公司)并避光保存于-20 ℃；羟甲基纤维素钠购于美国sigma公司；RPMI-1640购于美国hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自Amresco公司；双抗购于西安依科生物公司。SATB1单抗、E-cadherin单抗、Snail单抗购于美国Abacom；Wnt1多克隆抗体、β-catenin单抗、Vimentin单抗购于美国Cell Signaling Technology(CST)。山羊抗兔、抗鼠购于康为公司。SP试剂盒、DAB显色剂购于北京中杉金桥公司。PVDF膜购于Millipore(美国)。

1.2 细胞系和实验动物

人乳腺癌细胞系MD-MB-231购于American Type Culture Collection(ATCC,USA)。BALB/c雌性小鼠24只，购于西安交通大学动物实验中心，4～6周龄，体重为16～20 g；裸鼠饲养在SPF级环境下，恒温22 ℃～25 ℃，恒湿55%～56%，应用水、饲料及实验用品均经灭菌、消毒处理，实验室操作严格遵守无菌操作原则。

1.3 药品配制

Baicalein用二甲基亚砜(DMSO)稀释成100 mmol/L，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存，使用前解冻。羟甲基纤维素钠用蒸馏水稀释成0.5%的溶液，4 ℃保存。灌胃前将溶解的黄芩素悬浮于羟甲基纤维素钠溶液里。

1.4 细胞培养

MDA-MB-231细胞在高糖DMEM培养基(含10%小牛血清及100 U/L青霉素和100 μg/L链霉素)，37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每2天更换培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长的细胞用于后续试验。

1.5 建立裸鼠模型与动物分组及给药

取处于对数生长体外培养的MDA-MB-231高侵袭性乳腺癌细胞，细胞浓度调整至2×106/ml,无菌条件下，每只裸鼠经尾静脉注射2×105个细胞。每隔一周观察裸鼠的体重和健康状况。将裸鼠随机分为4组：空白对照组；黄芩素实验组；黄芩素低剂量预防组；高剂量预防组,每组6只。按体重计算裸鼠给药剂量，对照组、预防组低组和高组于注射细胞次日开始给药。实验组于注射细胞1个月后给药。实验组100 mg·(kg·d-1)，低剂量预防组50 mg·(kg· d-1)，高剂量预防组100 mg·(kg· d-1)。确定灌胃给药，1次/d,对照组给予等体积生理盐水灌饲，连续15天(表1)。接种细胞8周后，将各组裸鼠颈椎脱臼处死，取肝组织，分别称其质量。将肝组织固定于4%的多聚甲醛，48 h后在解剖显微镜下观察肝组织表面灰白色结节即转移灶和其数目(经验丰富的乳腺病理医师独立观察标本)。

表1 药物干预

注：a为预防组低剂量，b为预防组高剂量。

1.6 H-E染色

石蜡包埋的肝组织蜡块，切成5 μm厚。经二甲苯脱蜡和各级酒精水化后，苏木精染色，盐酸乙醇水化流水冲洗，1%伊红酒精溶液染色，蒸馏水稍洗，再经过脱水和透明后。中性树胶封片，进行图像采集和分析。

1.7 免疫组化法

载玻片经二甲苯脱蜡和各级酒精水化后，柠檬酸抗原修复液进行抗原修复，然后每张载玻片上组织滴加H2O2，37 ℃孵育20 min，滴加试剂A 37 ℃孵育15 min，然后滴加抗体SATB1(1∶100)，Wnt1(1∶200)，β-catenin(1∶100)，E-cadherin(1∶100)，Vimentin(1∶50)和 Snail(1∶80)4 ℃过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min；滴加试剂B，37 ℃孵育15 min；滴加试剂C，37 ℃孵育15 min；滴加DAB室温显色2 min，自来水冲洗3～5 min，苏木精复染3 min，自来水冲洗10 min，酒精脱水二甲苯透明，中性树胶封片，应用显微镜和图像采集系统软件分析。主要检测各组裸鼠肝组织中SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达。判断指标为：用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

结果判断：由经验丰富的乳腺病理医师独立观察切片。SATB1,Snail蛋白的阳性表达显示胞质或胞核染为淡黄色至黄棕色为阳性细胞。Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin阳性表达在细胞膜和细胞质中，呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞膜和细胞质染为淡黄色至棕色为阳性细胞。表达水平按照半定量法分为3级：-，无表达，染色强度与背景无明显差别；+,阳性细胞率<50%，染色强度介于两者之间；++，阳性细胞率>50%,染色强多数细胞呈黄色至棕黄色[1]。

1.8 Western blot

按照RIPA裂解液组提取肝组织蛋白，测定蛋白浓度，加入4×蛋白上样缓冲液混匀，沸水煮5 min，快速降至室温后上样，进行SDS-PAGE电泳。浓缩胶浓度5%，电压80 V，分离胶浓度10%，电压120 V。溴酚蓝刚跑至凝胶最低端即可终止电泳，转膜，PVDF膜激活后使用5%的脱脂奶粉或者5%BSA的TBST溶液中室温封闭2 h后,TBST洗膜一次15 min，孵育一抗SATB1(1∶1 000)，Wnt1(1∶1 000)，β-catenin(1∶1 000)，E-cadherin(1∶1 000)，Vimentin(1∶1 000)，Snail(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次15 min，孵育二抗(1∶5 000)，室温1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL发光液A∶B=1∶1混合，化学发光凝胶成像系统(Syngene 英国)曝光。实验重复3次。用Image-Pro Plus 6.0软件凝胶图象处理系统分析目的条带光密度值，其比值表示蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法

应用SSPS 18.0软件进行统计分析。两组计量资料的比较采用t检验，多组计量资料的比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肝组织的大体标本和H-E染色

经尾静脉注射肿瘤细胞后，小鼠体质稳定，状态良好。4%多聚甲醛固定48 h后肝组织的大体标本，于体视显微镜下观察，发现对照组的肝组织有少量的转移灶，实验组和预防组未发现肉眼可见的转移灶；对照组可见微小转移灶，在实验组和预防组未见明显的微小转移灶。

2.2 免疫组化结果

SATB1、Wnt1、β-catenin、Vimentin、Snail在对照组肝组织中显著表达(P<0.05)，在实验组和预防组中表达降低；E-cadherin在对照组肝组织中表达降低，而在实验组和预防组表达升高。各抗体的表达抑制率具体结果见表2。各组经统计学检验(P<0.05)，差异具有统计学意义。

2.3 Western blot 结果

结果分析(图1)肝组织SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达水平，胶片扫描仪采集图片。Image-Pro Plus 6.0测量蛋白条带灰度值，并分别以SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail的目的条带与内参β-actin条带灰度值得比值作为蛋白的相对表达量(表3)。结果显示实验组与对照组；预防组低剂量和预防组高剂量SATB1,Wnt1,β-catenin,E-cadherin,Vimentin,Snail各蛋白表达水平与对照组比较均有显著性差异，其中实验组和预防组中SATB1,Wnt1,β-catenin,E-cadherin,Vimentin,Snail蛋白表达水平与对照组相比降低，差异有统计学意义(P<0.05)；E-cadherin蛋白表达水平与对照组相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组蛋白的表达抑制率

注：与对照组相比,a为P<0.05。

表3 各组蛋白的相对表达量/%

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一[2-3]，而转移是乳腺癌进展的最后阶段，同时也是乳腺癌患者高死亡率的主要原因[4]，导致超过90%癌症患者死亡。正常的乳腺上皮细胞通过一系列连续的变化包括细胞基因和遗传表观的改变与微环境的相互作用而发生恶变、侵袭、转移[5]。目前对于转移的相关机制尚未完全清楚。寻找有效的毒副作用小的抗肿瘤侵袭转移药物，对提高乳腺癌疗效、改善预后、提高生存质量，具有重要的理论意义和临床应用价值。中药黄芩素是一种广泛使用的中草药，研究发现黄芩素在体内外有广泛的抗肿瘤的作用[6-10]，因此本实验研究主要在于发现黄芩素抑制乳腺癌细胞肝转移的影响及相关的作用机制。

国外大量的研究已经表明，SATB1作为“基因组组织者”调控大量转移相关基因并且在浸润性乳腺癌高表达和促进肺骨等远处转移[11]。Wnt/β-catenin信号通路也参与乳腺癌的远处转移。研究发现SATB1调控的转移相关基因如c-myc和bcl-2同时也被Wnt/β-catenin信号通路所调控，表明Wnt/β-catenin信号通路和SATB1之间有功能上的重叠作用。此外，在乳腺癌中SATB1通过调节β-catenin并与其相互作用，进而β-catenin结合到SATB1的作用靶位点[12]。研究同时也发现其与EMT的发生密切相关。越来越多的证据表明，EMT是许多肿瘤侵袭和转移早期的一个重要的过程。因此，我们可以假设黄芩素使通过下调SATB1的表达，阻止Wnt/β-catenin的信号通路，从而阻止EMT的发生，进而阻止乳腺癌的转移的发生。Gao等[12]研究发现黄芩素可显著降低人乳腺癌MDA-MB-231细胞中SATB1蛋白的表达，且呈浓度依赖性，因此黄芩素可通过抑制SATB1蛋白的表达而发挥抗乳腺癌细胞的侵袭转移作用。Chung等[13]的研究发现黄芩素在乳腺癌细胞中抑制EMT形成的发生。并且有学者研究也发现上皮的标志物如：E-cadherin 和catenin的减少或者丢失可能与乳腺癌的远处器官和淋巴结的转移相关。Matsuda等研究发现Wnt信号通路影响乳腺癌细胞MDA-MB-231的多个生物学性质。Smith等[14]研究发现在浸润性乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)中ERK2通过Snail的同种型激活导致EMT的发生与细胞的迁移增加和黏附减少相关。Vimentin 被称为EMT的标志物，高表达反应了晚期乳腺癌的高浸润性和耐药性。E-cadherin作为上皮的重要标志物，ElMoneim等[15]研究发现浸润性导管癌患者的病情的进展和预后的重要的特点即E-cadherin的减少。E-cadherin减少可能的机制为与染色质重组，甲基化及改建相关。在浸润性导管癌和各类乳腺癌细胞中，转录水平中CDH1启动子的甲基化和5 CpG区的重叠被验证与E-cadherin表达的丢失相关。因其缺乏动物实验的数据的验证，只能在体外发挥其作用，因此本实验通过黄芩素体内实验的验证，通过建立乳腺癌裸鼠模型，实验免疫组化结果为SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表达在对照组表达(++/+)，实验组表达(-/+-)，预防组低剂量(+)和预防组高剂量(+/+-)；E-cadherin在对照组表达(-)，实验组表达(+)，预防组低剂量(+)预防组高剂量(++)。Western blot 结果为黄芩素下调SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表达和上调E-cadherin蛋白的表达。经统计学检验P<0.05，各组蛋白表达水平均有显著的差异。本实验研究发现黄芩素下调乳腺癌转移相关蛋白如SATB1，Wnt1,β-catenin,Vimentin,Snail和上调E-cadherin的表达的影响。因此黄芩素抑制乳腺癌的转移可能机制是通过抑制SATB1蛋白的表达和EMT的发生，阻止Wnt1/β-catenin信号通路，从而减少乳腺癌肝转移的发生。进一步的验证还需在其他乳腺癌转移相关信号通路和基因的水平验证SATB1、Wnt/β-catenin信号通路和EMT三者相互关系与作用在乳腺癌远处转移的研究。本研究设计的不足之处是未设立阳性对照，希望后续实验设计研究中考虑并进一步的验证本实验的结果。

目前的相关研究表明，中药黄芩素的研究仅停留在基础研究阶段，尚未开展与临床相关的研究。本研究为黄芩素抗肿瘤转移的研究和开展临床试验增添了新的基础理论依据，为寻找安全有效的抗癌药物提供了新的思路。