泽泻汤加味方对高脂血症大鼠胃黏膜AQP4蛋白表达的影响

张兴芳 韩 雪 张一昕 王 茜 王亚芬 刘晨旭 王彦蕊

(河北中医学院，河北 石家庄 050200)

高脂血症(HLP)为临床常见病，现代常用的治疗药物有他汀类、贝特类等，虽疗效显著，但因胃肠道不适、肝肾损伤、肌肉酸痛等副作用而限制其临床应用〔1〕。近年来，中医药在防治HLP方面显示出多途径、多靶点、整体调节、不良反应较少的优势。临床研究认为脾失健运，湿聚痰生，壅滞血脉为其主要发病机制〔2〕，泽泻汤加味方具有祛湿消痰，健运脾胃之功。水通道蛋白(AQP)4蛋白表达在水液代谢起重要作用〔3〕。 本研究旨在观察泽泻汤加味方对HLP大鼠血脂及APQ4的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重160～180 g，由河北省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2实验药物 泽泻汤加味方组成：泽泻50 g、白术20 g、荷叶10 g(广东一方制药有限公司生产的中药配方颗粒，产品批号分别为：5073461、5063421、505037T，)将上述药物用100℃蒸馏水充分溶解，冷却辛伐他汀后冷藏备用。辛伐他汀片(石药集团，生产批号：380150701，国药准字：H20093007)，加入到0.5%羧甲基纤维素钠混悬液中搅匀，冷藏备用。

1.3实验试剂 三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)购自中生北控生物科技股份有限公司，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)购自长春汇力生物技术有限公司，一抗AQP4兔抗IgG多克隆抗体购自美国Bioworld公司，二抗山羊抗兔、SP9001试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4实验仪器 Humalyzer2000半自动生化分析仪(德国毫迈克公司)、TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)、全能显微镜 BX-UCB(日本 Olympus)，LEICA、RM2345石蜡切片机(莱卡上海分公司)。半干转膜仪系统(日本ATTO公司)、紫外可见分光光度计(美国Milton roy公司)、转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.5方法

1.5.1实验分组、造模、治疗及样本采集 将60只SD大鼠适应性喂养1 w后，按体重分层原则随机分为6组，每组10只，正常组、模型组、辛伐他汀对照组(对照组)、泽泻汤加味方高、中、低剂量组(高、中、低剂量组)。除正常组喂饲普通饲料外，其余各组均喂饲高脂饲料〔4〕(胆固醇1.5%、猪油10%、猪胆酸钠0.5%、普通饲料88%，由河北省实验动物中心加工)。从造模第1天起，正常组与模型组灌服蒸馏水，高、中、低剂量组分别组灌服29.56、14.78、7.39 g/kg泽泻汤加味方，对照组灌服辛伐他汀1.89 mg/kg，1次/d，用药体积均按 1 ml/100 g计算，共用药治疗5 w。用药后第5周末，大鼠禁食24 h，麻醉后股动脉取血，离心，分离血清待检。然后迅速剖取结肠，先取适当大小的结肠组织，剪开冲洗干净后，液氮保存，以备观察AQP4、AQP4 mRNA的表达，再取适当大小的结肠组织放于4%多聚甲醛液中固定，以备免疫组化观察。

1.5.2血清生化指标检测 股动脉取血，室温静置30 min后，4℃、3 000 r/min离心10 min，采集血清置于EP管中，用半自动生化分析仪检测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量变化。

1.5.3肝组织病理学观察 取大小约为1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的新鲜肝组织样本，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肝组织的形态学变化。

1.5.4免疫组化(SP)法观察胃黏膜AQP4的表达 将结肠组织切片，常规脱水，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4清洗，3%H2O2液室温下孵育20 min，PBS清洗，0.01 mol/L pH6.0 枸橼酸缓冲液微波炉内抗原修复30 min(92℃)，室温下冷却；PBS清洗，滴加山羊血清工作液封闭，37℃温箱湿盒内孵育30 min，吸去多余血清，滴加兔抗鼠的AQP4抗体，4℃冰箱孵育过夜，PBS清洗，滴加二抗工作液，孵育30 min，PBS清洗，滴加三抗工作液，孵育30 min，PBS清洗，DAB显色，光镜下监视，PBS充分冲洗，终止显色。对组织切片拍照后采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图象分析系统，在100×视野下每张切片取8个视野，测定平均光密度值作半定量分析。

1.5.5Western印迹法检测胃黏膜AQP4蛋白表达 取大鼠胃组织约100 mg，液氮研磨，然后转移到900 μl含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA溶解液中性裂解液当中，混匀，超声裂解，配平后4℃，12 000 r/min离心 15 min，收集上清，进行蛋白含量的测定。蛋白煮沸变性以后，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次，二抗室温孵育1.5 h，PBST洗膜3次，暗室曝光，X线胶片上显影，用Tanon Gis软件扫描各条带的吸光度值并分析结果。

1.6统计方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1泽泻汤加味方对HLP大鼠血脂的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C 的含量均明显升高(P<0.01)，HDL-C 含量明显降低(P<0.01或P<0.05)。药物干预后，各用药组TG、TC、LDL-C的含量均较模型组显著降低，HDL-C含量均显著升高(P<0.01或P<0.05)；与对照组相比，高剂量组血脂各项指标无明显变化(P>0.05)，中、低剂量组TG、TC、LDL-C含量显著升高，HDL-C含量显著降低(P<0.01或P<0.05)；泽泻汤加味方各剂量组之间比较，高剂量组TG、TC、LDL-C的含量显著低于中、低剂量组(P<0.01或P<0.05)，HDL-C的含量显著高于中、低剂量组(P<0.05)；与低剂量组相比，中剂量组TC含量显著降低(P<0.05)，见表1。

2.2泽泻汤加味对HLP大鼠肝组织病理形态学的影响 正常组肝细胞排列整齐，形状为规则六边形，围绕中央静脉呈放射状分布，肝血窦结构正常，无脂肪滴和炎性浸润。模型组大鼠肝细胞排列不整齐，且出现大量脂肪滴，细胞核位置被挤压偏离，肝血窦充血水肿。对照组肝细胞结构清晰，脂肪滴明显减少，肝血窦充血水肿减轻，但存在细胞坏死及炎性浸润。泽泻汤加味方高、中、低剂量组较模型组结构排列清晰，脂肪滴也不同程度减少，肝血窦形态趋于正常，尤以高剂量组效果显著。见图1。

2.3免疫组化法检测各组胃黏膜AQP4的表达情况 正常组胃黏膜上皮细胞阳性细胞表达较少，着色较浅。模型组胃黏膜上皮细胞的细胞核、胞质着色较深，表达较多，上皮细胞下方的平滑肌细胞阳性表达较少。对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组阳性细胞的表达及着色程度依次降低。半定量分析显示：模型组大鼠胃黏膜AQP4的表达较正常组显著升高(P<0.01)；各用药组AQP4的表达均显著低于模型组(P<0.01)；其中，高、中、低剂量组显著低于对照组(P<0.01或P<0.05)；高剂量组显著低于低剂量组(P<0.05)，与中剂量组无差异(P>0.05)；中剂量组显著低于低剂量组(P<0.05)，见表1，图2。

2.4Western印迹检测各组胃黏膜AQP4蛋白的表达情况 模型组大鼠胃黏膜AQP4的表达较正常组显著升高(P<0.01)；各用药组AQP4的表达均显著低于模型组(P<0.01)；其中，高、中剂量组显著低于对照组(P<0.01)；高剂量组显著低于低剂量组(P<0.01)，与中剂量比较差异无统计学意义(P>0.05)；中剂量组与低剂量组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1，图3。

表1 各组血清 TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量及胃黏膜组织APQ4蛋白相对含量比较

与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01;与高剂量组比较：5)P<0.05，6)P<0.01；与中剂量组比较： 7)P<0.05

图1 各组肝组织的形态变化(HE，×200)

图2 各组胃黏膜中AQP4的表达(SP，×200)

1：正常组 2：模型组 3：对照组4：低剂量组 5：中剂量组 6：高剂量组图3 各组胃黏膜中AQP4蛋白的表达

3 讨 论

中医中据HLP临床表现、体征及舌脉等特点，可归属于“痰浊”、“血瘀”等范畴〔4〕，临床多分为肝气郁证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、肾阳虚证、痰瘀内阻证、阴虚阳亢证等6种证型予以辨治〔5〕。该病的发生多是由饮食饥饱失节、偏嗜醇甘厚味、久坐怠惰懒动、情志抑郁失畅等致使脾运功能下降，升清降浊失职，水湿停聚成痰，痰浊停积生成“脂膏”，注入血液、壅塞血脉而诱发。痰浊是导致血脂异常的主要物质基础，脾失健运，痰浊内生为其主要病机，健脾祛湿消痰为其有效治法。有学者对脾虚状态下HLP大鼠的胆固醇代谢进行研究发现，因脾虚运化失常导致的HLP胆固醇水平明显升高，且肝脏出现脂质沉积，揭示了“脾主运化”对肝脏脂质代谢的调控作用〔6〕。泽泻汤加味方是在《金匮要略》泽泻汤的基础上加入荷叶而成，方中泽泻利水道、祛水湿、消痰浊、降血脂，白术补气健脾、燥湿利水，既健脾益气以助运化，又祛痰湿，荷叶升清降浊，祛湿利尿，三药同用，驱邪扶正，标本兼顾，共奏消痰祛浊，健运脾胃之功，临床以此为基础方剂随证加味，获效较佳。

AQP在20 世纪 90 年代被发现于细胞膜上具有“转运水”的特异性通道蛋白，在人体水液代谢中发挥不可替代的作用，共有13个亚型，AQP0～12，存在于人体各个组织器官中〔7〕，AQP4 主要集中在胃体部黏膜的中部和底部，多在胃腺体主细胞膜和壁细胞膜的基侧面分布表达。AQP与中医的湿病关系密切〔8〕，为探讨中医药在防治与水液代谢失常所致疾病的研究中提供了新的方向。目前基于AQPs途径防治HLP的报道较少，但有关通过调控胃黏膜AQPs的表达，调节水液代谢防治脾胃疾病的报道较多。李合国等〔9〕通过检测慢性浅表性胃炎(经中医辨证属于脾胃湿热证和脾虚证)患者胃黏膜中AQP3、4的表达，认为其表达升高可能是脾失健运，水液运化失常的病理基础。韦嵩等〔10〕通过实验研究观测脾胃湿热大鼠胃黏膜组织中AQP4的表达，也认为其表达增强可能是脾胃湿热证发生的机制之一。娄勤进等〔11〕开展了腹水草水提液对胃溃疡大鼠胃组织中AQP4表达的影响实验研究，认为腹水草通过降低AQP4的表达调节胃内水液代谢的平衡从而达到保护胃黏膜的作用。因此，胃黏膜AQP4的表达与水湿的生成关系密切。

本研究证实了血脂异常与胃黏膜AQP4的表达具有相关性，由于AQP4表达上调，使细胞分泌及水的跨膜转运出现异常。经泽泻汤加味方治疗后，体内水分重吸收过度，泽泻汤加味方是通过调控AQP4表达调节水液代谢。