不同贝壳煅烧粉的杀菌及抑菌效果

, , , , ,徐君

(1.舟山出入境检验检疫局,浙江舟山 316021; 2.浙江海洋大学,浙江舟山 316021)

食品保鲜技术主要包括物理、化学和生物方法。物理方法因使用范围、操作技术等限制,推广受限,如微波杀菌难以评估杀菌的效果和安全性[1];红外杀菌穿透力并不强,只适合食品表面杀菌[2];辐照杀菌的机理及辐射降解药物残留的安全性有待进一步研究[3]。化学防腐剂如亚硝酸盐、苯甲酸钠等都具有一定的毒性,而生物保鲜具有无毒、无味、安全等特点。因此寻找安全无毒的生物保鲜方法,用于取代化学保鲜方法已成为人们关注的热点。目前，在抗菌保鲜天然成分的研究上,较多的集中在从陆生植物中提取的抗菌活性成分方面,而从海洋生物中寻找抗菌活性成分的研究,虽然涉及到壳聚糖、海藻低聚糖等,但与海洋巨大的资源相比,是远远不够的。

我国贝壳资源极其丰富且品种繁多,近年来贝类的产量和加工量每年已达到数百万吨甚至上千万吨[4],但同时产生大量的废弃物,每年都有数百万吨的空贝壳被丢弃在海岸边,破坏环境。因此国内外学者开始关注废弃贝壳的利用。在环境治理领域,有报道称将贝壳热解成CaO,可除富营养化水体中的磷污染[5]、去除废水中的重金属[6-7],在生物滤池中加贝壳作为填料,可用于工业废水处理[8]。在食品领域,除部分贝壳作为肥料和禽畜饲料的添加剂外[9],研究还表明，煅烧贝壳粉可以用于去除水果蔬菜表面农药残留[10],具有较强的除菌和脱臭能力[11],经高温灼烧后制取活性氧化钙,对猪瘦肉、豆腐干[12]、储粮霉菌[13]具有防腐抑菌效果。任慧等[14]研究了扇贝对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果,魏巍等[15]用扇贝对黄瓜、单环刺缢扇贝进行了抑菌实验,但未见系统地研究贝壳粉煅烧物对常见致病菌的杀菌及抑菌效果的报道。因此,本文选取文蛤、贻贝、缢蛏这3种常见贝壳,经高温煅烧获得贝壳煅烧粉,评估其对常见致病菌的杀菌以及抑菌能力,研究贝壳煅烧粉作为天然保鲜剂的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

文蛤、贻贝、缢蛏 浙江省舟山市南珍鲜活海产品市场;大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙门氏菌(CMCC50115) 广东省微生物菌种保藏中心;副溶血弧菌(CICC 21617) 中国工业微生物菌种保藏中心;脑心浸液肉汤、DHL琼脂、Barid-Parker琼脂、EMB琼脂、TCBS琼脂 北京陆桥生物技术有限公司;氯化钠(分析纯) 国药集团;菌落计数纸片 3M公司。

SX2-2.5-12型高温马福炉 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;QE型高速中药粉碎机 武义县屹立工具有限公司;BK1610培养箱 THERMO德国公司;KS12生物安全柜 THERMO德国公司;MLS-3750高压灭菌锅 日本三洋;ME2002E电子天平 瑞士梅特勒公司;IKA MS3混合器 广州仪科实验室技术有限公司;Advantage10纯水仪 德国Milipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 贝壳煅烧粉的制备 材料预处理:将贻贝、文蛤、溢蛏于适量水中煮至贝壳自然开口,取出贝壳闭壳肌及内脏等内容物,将贝壳冲洗干净,于自然条件下晾干,称取适量于中药粉碎机中粉碎5 min,粉碎3次,过150目筛,备用。

高温煅烧:称取适量粉碎好的贝壳粉于6个坩埚中,每2个坩埚设为一组,每组温度分别为1000 ℃,煅烧时间为2 h。然后将贝壳粉置于烘箱中,以180 ℃烘干20 min,于干燥器内冷却后备用。通过称量贝壳粉灰化前后质量,计算贝壳粉失重率,确认贝壳粉灰化完全[16]。

1.2.2 贝壳煅烧粉悬浊液的制备 将1.2.1所得的3种贝壳煅烧粉,用0.85% NaCl生理盐水配成10%浓度的母液备用。根据实验需要,将10%浓度的贝壳煅烧粉母液稀释成1%、0.1%、0.01%浓度的贝壳煅烧粉悬浊液。

1.2.3 受试菌株准备 将实验室保藏的菌种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和沙门氏菌接种于脑心浸液肉汤(副溶血弧菌为盐度2% NaCl的脑心浸液肉汤)培养基,36 ℃活化培养(24±2) h后,分别划EMB平板、Baird-Park平板,TCBS平板和DHL平板,36 ℃培养(24±2) h,分别挑取典型单菌落接种于90 mL的脑心浸液肉汤培养基中(副溶血弧菌接种到2% NaCl的脑心浸液),36 ℃培养(18±2) h,使每毫升培养液中初始菌数达108CFU/mL以上,作为受试菌株。利用3M菌落总数测试片进行菌落总数测定。

1.2.4 贝壳煅烧粉抑菌能力的测定

1.2.4.1 贝壳煅烧粉对食品病原菌的杀菌作用研究 吸取10%浓度的贝壳煅烧粉悬浮液10 mL,分别加入到90 mL含不同菌的菌悬液中,制成1%浓度的贝壳煅烧粉混合液。该混合液中,初始菌达108CFU/mL以上,分别于26 ℃下作用1、5、10、20、30 min后,适当稀释后,利用3M纸片进行菌落计数。

1.2.4.2 贝壳煅烧粉对食品病原菌的抑菌作用研究 本实验采用琼脂扩散法的牛津杯[17]评价贝壳粉抑菌剂的抑菌活力。通过抑菌圈直径的大小来确定抑菌剂抑菌能力的强弱。将复活的菌种接种于盛有普通细菌培养基的克氏瓶中,36 ℃培养(20±2) h后,用灭菌生理盐水洗下菌苔,制成菌悬液。将菌悬浮液接种至pH7.2的琼脂液(副溶血弧菌接种到含2% NaCl的琼脂液)中,直至浓度为5×105CFU/mL琼脂。将20 mL被接种过的琼脂液倒在平板上,然后放在冷的平板上冷却。

用无菌镊子将灭菌的牛津杯轻轻放入培养皿中,在水平放置的培养皿中均匀放置3只牛津杯。用移液枪精准吸取0.1、0.01、0.001 g/mL三个浓度的贝壳粉抑菌剂200 μL至牛津杯中。同时吸取无菌水作为对照。将加入抑菌剂的培养皿在(3～4) ℃冰箱中静置30 min,然后在受试菌最适生长温度37 ℃下,培养24 h,测量抑菌圈直径。平行实验3次,求其平均值。

2 结果与分析

2.1 不同贝壳煅烧粉对食品病原菌的杀菌作用

由表1～表3可知,3种贝壳煅烧粉对4种菌均具有杀菌作用,但杀菌效果不同。贻贝壳煅烧粉对4种菌的作用大小为:大肠杆菌>副溶血弧菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌;文蛤壳煅烧粉:副溶血弧菌>大肠杆菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌;缢蛏壳煅烧粉:副溶血弧菌>大肠杆菌≈沙门氏菌>金黄色葡萄球菌。相比于大肠杆菌、沙门氏菌以及副溶血弧菌,3种贝壳煅烧粉对金黄色葡萄球菌的杀菌作用较弱,表明3种煅烧贝壳粉对于G-菌的杀菌作用明显大于G+菌。推测可能由于G+菌因细胞壁由肽聚糖及磷壁酸所组成,结构坚硬且较厚;G-菌细胞壁所含的肽聚糖较薄,约为革兰氏阳性菌细胞的十分之一,且无强化功能的磷壁酸,故较为脆弱,而其外层含有脂蛋白、磷脂、脂多糖等,于碱性环境下易受破坏而变性。

表1 贻贝贝壳煅烧粉对食品病原菌的杀菌作用Table 1 Bactericidal effect of calcined shell powder of Mussels on food borne pathogens

表2 文蛤贝壳煅烧粉对食品病原菌的杀菌作用Table 2 Bactericidal effect of calcined shell powder of Meretrix meretrix on food borne pathogens

表3 缢蛏贝壳煅烧粉对食品病原菌的杀菌作用Table 3 Bactericidal effect of calcined shell powder of Sinonovacula constricta on food borne pathogens

相比于贻贝、文蛤,缢蛏对于4种菌的作用效果相对较强。对于沙门氏菌的杀菌作用,缢蛏>贻贝=文蛤,缢蛏作用10 min 后沙门氏菌小于10 CFU/mL;对于副溶血弧菌,作用效果最好的为文蛤以及缢蛏壳煅烧粉,作用5 min后,均小于10 CFU/mL;对于大肠杆菌,3种煅烧粉作用对其作用基本相同,作用10 min后均小于10 CFU/mL。对于金黄色葡萄球菌,缢蛏=贻贝>文蛤。

2.2 不同贝壳煅烧粉对食品病原菌的抑菌作用

由培养基扩散法初步确定贝壳煅烧粉对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和大肠杆菌的抑菌能力大小。根据文献[18]对抑菌作用的判断:抑菌圈直径小于或等于7 mm者,判为无抑菌作用。抑菌圈直径大于7 mm者,有弱抑菌作用;抑菌圈在(10～20) mm者,有中等抑菌作用。抑菌圈直径大于20 mm者,有强抑菌作用。由表4～表6,贝壳粉有抑菌作用,且不同贝壳粉对不同菌的抑菌效果不同。贻贝贝壳煅烧粉对副溶血弧菌的抑菌性明显强于沙门氏菌以及大肠杆菌,且在0.1 g/mL浓度下贻贝贝壳煅烧粉对副溶血弧菌的抑菌作用最强,抑菌圈直径达16.24 mm。文蛤贝壳煅烧粉对副溶血弧菌的抑菌性明显强于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌,且在0.1 g/mL浓度下文蛤贝壳煅烧粉对副溶血弧菌的抑菌作用最强,抑菌圈直径达16.00 mm。缢蛏壳煅烧粉在高浓度即0.1 g/mL对沙门氏菌的作用最强,抑菌圈达16.42 mm,但在低浓度时,对副溶血弧菌的抑菌作用最强,抑菌圈达9.46 mm。

表4 贻贝贝壳煅烧粉对食品病原菌的抑菌作用Table 4 Inhibitory effect of calcined shell powder of Mussels on food borne pathogens

表5 文蛤贝壳煅烧粉对食品病原菌的抑菌作用Table 5 Inhibitory effect of calcined shell powder of Meretrix meretrix on food borne pathogens

表6 缢蛏贝壳煅烧粉对食品病原菌的抑菌作用Table 6 Inhibitory effect of calcined shell powder of Sinonovacula constricta on food borne pathogens

3 结论

本文通过对沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌进行菌液的杀菌实验以及培养基扩散法的抑菌实验。结果表明，3种贝壳煅烧粉对4种菌均具有杀菌作用,但对金黄色葡萄球菌的杀菌作用较弱,对于G-菌的杀菌作用明显大于G+菌。作用最强的为缢蛏及文蛤贝壳煅烧粉对副溶血弧菌，作用5 min后菌落总数均小于10 CFU/mL。由培养基扩散法的抑菌实验表明，3种贝壳煅烧粉对4种菌均有抑菌作用：抑菌效果最强为缢蛏贝壳煅烧粉在0.1 g/mL浓度下作用于沙门氏菌，抑菌圈直径达16.42 mm；在各浓度阶段，贻贝和文蛤贝壳煅烧粉对副溶血弧菌的抑菌性明显强于于沙门氏菌以及大肠杆菌。因此不同的贝壳煅烧物都有一定的杀菌和抑菌作用,但效果有差异。因此进一步对贝壳煅烧粉的成分进行分析,将有助于对杀菌以及抑菌机理及效果的研究。本研究为贝壳煅烧粉用作食品抑菌剂进行了初探。