人源性肝癌细胞小鼠原位移植瘤模型的建立及特点的比较研究

尹 君，李景丁莎，左从林，张惠铭，佘锐萍

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193； 2.北京昭衍新药研究中心股份有限公司, 北京 100176)

肝细胞癌是最为常见的一种恶性肿瘤，我国每年约有38.3万人死于肝癌，约占全球肝癌死亡总数的51%[1]。2015年中国癌症流行病学统计表明，我国肝癌的发病及病死率均居于第3位[2]。肝癌恶性程度较高、病情进展快，大部分患者(> 80%)就诊时已为晚期，不适合手术切除。即便可以手术切除的肝癌，2年复发率也高达50%。传统化疗后平均中位生存期仅为3～5个月[3]。肝癌治疗药物主要集中于传统化疗药物—细胞毒性药物的研究，以及通过研究肝癌发病机制开发其他类型的新药，如基因药物以及分子靶向药物等[4]。因此，选择成熟并有价值的动物肝癌模型进行研究，显得极为重要。目前，可用于药物研发用的肝癌动物模型种类很多，其中肝内移植肿瘤细胞的动物模型是最接近人类原发肝癌的模型，由于其对技术要求较高，且需要用到免疫缺陷小鼠作为动物载体，因此在治疗肝癌药物的研发中的应用还不是十分广泛[5]。本实验应用三种不同人源性肝癌细胞原位移植于不同程度免疫缺陷小鼠肝内，通过对比分析肝肿瘤发生率、肿瘤大小以及动物死亡情况，以建立较为成熟并有价值的肝癌细胞移植模型，为抗肝癌药物的研发提供一定的数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级BALB/c裸鼠30只[SCXK(京)2012-0001]，体重14～16 g，4～5周龄。SPF级NOD-SCID 小鼠30只[SCXK(京)2012-0001]，体重14～16 g，4～5周龄。SPF级NOG小鼠30只[SCXK(京)2011-0011]，体重14～16 g，4～5周龄。SPF级NPG小鼠30只[SCXK(京)2014-0001]，体重14～16 g，4～5周龄。均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物饲养及无菌手术于本中心SPF级动物房[SYXK(京)2014-0006]中进行。本实验IACUC编号为：ACU16-219。实验操作过程中遵循3R原则。

1.1.2 人源肝癌细胞

人肝癌细胞HepG2：购自上海南方模式生物研究中心，培养条件为DMEM(高糖)+10% FBS，37℃、5% CO2培养；人肝癌细胞HUH-7：来源于中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心，培养条件为DMEM(高糖)+10% FBS，37℃、5% CO2培养；人肝癌细胞QGY-7703：购自中国典型培养物保藏中心细胞库，培养条件为1640+10% FBS，37℃、5% CO2培养。

1.2 主要试剂与仪器

全封闭式组织脱水机(Asp300，LAICA，美国)、组织包埋机(EG1150H，LAICA，美国)、半自动轮转切片机(RM2235，LAICA，美国)、摊片烤片一体机(CS-VI，LAICA，美国)、全自动染色封片一体机(CV5030，LAICA，美国)，恒温烤箱(DRP-9082，中国)，生物显微镜(CX31，奥林巴斯，日本)，便携式彩色多普勒超声诊断仪(S8Exp，深圳开立生物医疗科技股份有限公司，中国)。二甲苯、乙醇(北京化工厂，中国)，苏木素、伊红(北京世济合力生物科技有限公司，中国)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

BALB/c裸鼠、NOD SCID 小鼠、NOG小鼠和NPG小鼠每个种属30只动物分成12组，每组10只，分别接种HepG2细胞、HUH-7和QGY-7703细胞。(表1)

1.3.2 实验操作

用基质胶调整HepG2细胞至8.5×107/mL，HUH-7细胞调整至4.7×107/mL，QGY-7703细胞调整至1.25×108/mL，然后分别以每只0.06 mL原位接种于动物肝。将待接种动物戊巴比妥钠麻醉后，腹部切口暴露肝左外叶，使用无菌注射器将细胞悬液接种于肝组织中，单点注射，干棉球压迫止血后缝合肌肉和皮肤切口。

应用小动物B超成像仪对接种肿瘤动物进行观察，确认是否有肿瘤组织生长。对实验期间死亡动物以及计划安乐死动物(第92天和第104天)进行大体解剖，对主要脏器进行观察。并取材各主要脏器(包含肝、心、脾、肺、肾、脑)，用于组织病理学检查，以观察肝肿瘤和其他脏器的肿瘤转移发生情况。统计小鼠生存时间和脏器重量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 动物死亡情况

本实验中，各实验组动物在手术过程中均出现死亡，由于死亡动物数量较少(不超过30%)，因此认为手术中动物的死亡不影响本实验研究。(表2)

2.2 移植瘤模型的建立

应用小动物B超成像仪，在实验开始1个月以后，对接种肿瘤动物进行超声检查，确定实验动物肝组织区域均可见密度增强区域(参见图1a)。对死亡动物及安乐死动物进行大体解剖，发现小鼠肝均可见肿瘤结节，多呈结节状突起，色泽苍白，肿瘤组织与周围肝组织界限较为清楚。切面呈灰白色，质软。结合B超成像结果(参见图1b)以及大体解剖观察，确认成功造模，三种肿瘤细胞均可成功移植。

表1 实验动物分组Table 1 Grouping of the experimental animals

表2 手术实施过程中动物死亡统计表Table 2 Animal death during operations

注：a：B超结果显示小鼠肝处长度为6.77～4.51 mm区域密度增强，确认为肿瘤结节区域；b：NOG和NPG小鼠生存时间显著低于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠。图1 肝B超图片和HepG2肝癌细胞悬液注射不同免疫缺陷小鼠生存曲线图Note. a: B-mode ultrasonography showed that the density of the mouse liver at the region of 6.77 to 4.51 mm was is increased and confirmed as the tumor nodule region; b: Survival curves of the various immunodeficient mice injected with HepG2 hepatoma cell suspensions showed that the survival time of NOG and NPG mice was significantly shorter than that of BALB/c nude and NOD SCID mice.Figure 1 Mouse liver B-mode ultrasonography and survival curves of the various immunodeficient mice injected with HepG2 hepatoma cells

2.3 组织学检查

各实验组动物肝组织均可见大量的人源性肝癌细胞，并具有大量病理核分裂像，同时组织中心部位大面积坏死(参见图2)。

2.4 HepG2组实验结果

各实验组小鼠均于实验第20天左右发生死亡。其中NOG小鼠和NPG小鼠平均生存时间显著低于BALB/c裸鼠以及NOD SCID小鼠。中位生存时间也显著低于BALB/c裸鼠以及NOD SCID小鼠。

各实验组小鼠动物肝均可见肿瘤细胞生长，因各组实验动物生存时间不同，不再进行脏器重量的统计。(表3～4)

2.5 HUH-7及QGY-7703组实验结果

各实验组仅BALB/c裸鼠未发生意外死亡，且随着动物免疫缺陷程度越高，动物死亡率也就相应增加，因此动物死亡与免疫缺陷程度呈一定的相关性。

HUH-7和QGY-7703肝癌细胞接种动物后，NOG小鼠和NPG小鼠肝重量显著大于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，差异显著(参见表5， 图3)。说明HUH-7和QGY-7703肿瘤细胞在NOG小鼠和NPG小鼠肝中生长更加迅速。

3 讨论

原位移植瘤模型是近年发展的新热点，可以模拟肝癌的发生、发展及结局，是最接近人类原发肝癌的动物模型[6]。朱瑞东等[7]将人HepG2细胞移植于小鼠皮下并成瘤，然后用此移植瘤组织再接种于小鼠肝内，建模成功率为90%；韩客起等[8]使用肝癌细胞株H22建立异位移植模型，肝原位移植瘤成模率达到95.6%。除原位接种肿瘤细胞以外，Soares等[9]从脾门静脉中注射肿瘤细胞，从而建立小鼠肝肿瘤原位移植模型，White等[10]经超声引导下，经皮植入肿瘤细胞从而建立兔肝肿瘤模型。综合上述文献报道已知，国内外已经有很多学者致力于肝癌动物模型的研究，但是基本还是以正常动物或者免疫缺陷程度有限的裸鼠等作为肝癌动物载体，这些动物自身具有一定的免疫力，肝癌细胞的生长受到一定的抑制作用，因此很难满足在新药研究实验中对模型动物建模周期短，肝癌恶性程度大的要求。

BALB/c裸鼠是由于基因突变造成的，缺乏成熟T细胞，但B淋巴细胞正常。NOD SCID小鼠第16对染色体上存在单个隐性突变基因以及VDJ重组酶活性异常，可以阻止功能性T、B淋巴细胞的分化，造成细胞和体液免疫功能均缺陷。NOG小鼠由日本实验动物研究所通过杂交NOD SCID小鼠和γ-链IL-2受体敲除小鼠而建立，这种小鼠主要缺乏T、B淋巴细胞以及NK细胞。NPG小鼠是维通达自主研发的基因缺陷小鼠，也是通过杂交NOD SCID小鼠和γ-链IL-2受体敲除小鼠，与国外NOG小鼠一致。上述动物模型因其存在不同程度的免疫缺陷，在实际应用中也存在一定的差异，如死亡时间、成瘤大小、肿瘤增殖程度等，目前国内对于不同免疫缺陷模型动物肝癌模型的比较研究还缺乏数据研究。

组别Groups1组BALB/c裸鼠Group 1BALB/c nude mice2组NOD SCID小鼠Group 2NOD SCID mice3组NOG小鼠Group 3NOG mice4组NPG小鼠Group 4NPG mice数量Number9998平均生存时间(d)Average survival day26.9±5.528.1±6.318.8±2.6▲△17.5±5.9▲△中位生存时间(d)Median survival day28272017

注：1组和2组比较，▲P<0.001；1组和2组比较，△P<0.01。

Note. Compared the group 1 with group 2,▲P<0.001. Compared the group 1 with group 2,△P<0.01.

表4 HUH-7及QGY-7703组小鼠死亡情况统计表Table 4 Mice deaths in the HUH-7 and QGY-7703 groups

表5 HUH-7细胞及QGY-7703细胞接种小鼠肝重量统计表Table 5 Liver weights of the HUH-7 cell-injected mice

注：5组和6组比较，*P<0.05。9组和10组比较，**P<0.05。

Note. The group 5 compared with group 6,*P<0.05. The group 9 compared with group 10,**P<0.05.

注：a： HUH-7细胞植接种动物肝大体观察照片：第7组(NOG小鼠)和第8组(NPG小鼠)动物肝体积显著大于第5组(BALB/c裸鼠)和第6组(NOD SCID小鼠)动物肝。b：QGY-7703细胞接种动物肝大体观察照片：第11组(NOG小鼠)和第12组(NPG小鼠)动物肝体积显著大于第9组(BALB/c裸鼠)和第10组(NOD SCID小鼠)动物肝。除5组和9组外，各实验组均有部分小鼠在手术移植肝癌细胞期间死亡(未形成肝癌结节)或者在实验期间意外死亡，未能收集到肝肿瘤标本，但是肿瘤结节随免疫缺陷程度增加而逐渐增大。图3 小鼠肝大体观察照片Note. a: Livers from HUH-7 cell-injected mice. Liver volumes of group 7 (NOG mice) and group 8 (NPG mice) were significantly greater than those of group 5 (BALB/c nude mice) and group 6 (NOD SCID mice). b: Livers injected with QGY-7703 cells. Liver volumes of group 11 (NOG mice) and group 12 (NPG mice) were significantly larger than those of group 9 (BALB/c nude mice) and group 10 (NOD SCID mice). Except for groups 5 and 9, some mice in each group died during surgical transplantation of hepatocellular carcinoma cells (no hepatocarcinoma nodules were formed) or died unexpectedly during the experimental period. Therefore, hepatic tumor specimens could not be collected. However, tumor nodules were increased gradually with the degree of immunodeficiency.Figure 3 Gross observation of the mouse livers

本实验应用不同程度免疫缺陷的BALB/c裸鼠、NOD SCID小鼠、NOG小鼠和NPG小鼠原位接种三种人肝癌细胞并进行比较研究。直接注射人肝癌HepG2细胞后，各组小鼠均在短期内发生死亡，死亡时间大多在20 d左右。项亮亮等[11]也曾用昆明小鼠注射肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位和异位移植模型，模型动物的平均自然生存期为28 d。王书杰等[12]利用Wistar大鼠将Walker-256瘤株分别进行注射、原位移植和改良注射方法制备人源化肝肿瘤模型，结果显示模型鼠存活时间较短，50%以上大鼠在第18天发生死亡。赵然等[13]利用BALB/c裸鼠进行HepG2细胞皮下接种和原位接种的比较研究，结果显示HepG2皮下接种和原位细胞接种成瘤率均为100%，整个实验周期内(50 d)未见小鼠发生死亡。直接注射细胞法的接种肿瘤细胞的动物生存期一般较短，一般取决于肝癌细胞恶性增殖的程度(如HepG2细胞)，恶性程度较高的肿瘤细胞可使动物在短期内迅速死亡；另一方面肿瘤细胞注射后，随肝血液系统进行分散定植，极易形成其它脏器的转移。而恶性增殖程度较低的HUH-7和QGY-7703细胞，则一般可存活至实验周期结束(大致90天左右)。因此在进行抗肿瘤药物的评价时，需要考虑肿瘤细胞接种量，动物生存期以及给药途径和给药周期。

本实验中HepG2细胞组的NOG和NPG小鼠存活时间要明显短于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，可见对于免疫系统缺陷程度更高的模型鼠来讲，更利于肿瘤细胞生长并可以导致模型动物快速死亡，缩短实验研究周期。HUH-7和QGY-7703细胞组的NOG和NPG小鼠肝重量显著大于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，且死亡率也高于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，因此NOG和NPG小鼠是更为理想的模型动物。

总之，本实验研究系统地比较了三种肝癌细胞直接注射不同免疫缺陷小鼠肝的方法，观察比较不同动物在肝癌细胞移植后的各种指标变化，为抗肝癌药物的筛选实验提供了更为科学的动物模型，为进一步研究肝癌提供了有价值的数据资料。