用于实验用猫群体遗传分析的微卫星位点筛选

贾松华，王 洪，魏 杰，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

猫(cat;Feliscatus)隶属哺乳纲(Mammals)、食肉目(Carnivora)、猫科(Felidae)、猫属(Felis)。染色体数2n=38。目前，猫在全世界的拥有量约6亿只[1]，为其在科研方面的应用提供了丰富的猫资源。据OMIA(ONLINE MENDELIAN INHERITANCE IN ANIMALS)网站的统计分析，截止2018年6月，在猫中发现的与人类同源的遗传性疾病有208种。同时，猫使人类更深入地了解了一些急性感染性疾病的相关机理和生物学特性。历史上很多致癌基因的信号转导通路最初是在携带有白血病病毒的猫动物模型中发现的[2]；转基因鼠和猫是研究人类免疫缺陷病毒(HIV)时应用最多的两类非灵长类动物[3- 4]；感染有冠状病毒(FeCoV)的猫对于研究SARS的临床症状是一个重要的切入点[2]。此外，猫是研究神经生理学，药理学的热门动物。它是我国药典在检查药品的降压物质时指定的实验用动物[5]，也是研究脑神经以及眼科的绝佳材料[6]。

鉴于猫丰富的科学实验价值，有必要对猫进行实验动物化培育。在猫的实验动物化进程中，初筛过的猫必须进行严格的微生物净化、遗传及饲养环境等因素的控制。目前，国外对猫群体的饲养繁育、质量控制、品系培育等经验丰富。例如，宾夕法尼亚大学在1974年构建了RCAM(Referral Center for Animal Models of Human Genetic Disease)系统，其保存的猫疾病模型在研究与人类同源的遗传性疾病中具有不可或缺的位置[7]。NIH(National Institutes of Health)自1978年在其动物中心建立了封闭群猫种群[8]。苏黎世大学目前已培育有SPF级的实验用猫[9]。与之相比，我国实验用猫资源紧缺，多数实验用猫购自市场，经隔离检疫、严格筛选后使用；目前为止，我国90%以上的教学科研实验用猫都是从商贩或“收购型饲养场”购买。其来源混杂，遗传背景模糊，所携带微生物不明等情况，对实验结果的准确性、科学性以及重现性都有直接影响[10-12]。为了提高实验用猫的质量，使其更易于做科研和生产，我国的一些单位近年来也建立了实验用猫的群体。比如，华北制药厂定向培育成了虎斑猫的常染色体隐性突变品系—虎皮猫[13]；自2003年大连医科大学也开始了猫的封闭饲养繁育[14]。

微卫星[15](microsatellite)又称为短串联重复序列(short tandem repeat, STR)或称简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)，是指以少数几个核苷酸(一般为1～6 bp)为单位，经多次重复(重复10～60次左右)单位组成的简单多次串联重复序列，如(CA)n，(TG)n。由于微卫星具有分布广泛且均匀、多态性丰富、通用性及保守性等特点，使其迅速成为了第二代DNA遗传标记，在小型猪[16]，豚鼠[17]，兔[18]等多种实验动物的遗传质量检测中广泛应用。为了能够在猫的实验动物化进程中提供遗传控制的技术支持，本课题组通过检索国内外相关文献报道，备选了74个具有多态性的微卫星位点进行实验用猫的遗传质量检测。最终，本研究成功筛选出了31个富含多态点且均匀分布于18对常染色体上的微卫星位点。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验所用家猫、暹罗猫血液样本均由大连医科大学实验动物中心提供。经舒泰麻醉后，无菌采集前肢抗凝血，冷链运输至实验室，并于4℃保存备用。家猫的样本量为16只，暹罗猫的样本量为10只。动物实验过程中遵循3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

Bio-Rad PowerPar Basic型电泳仪，NanoPhotometer 型DNA微量分析仪，ABI VeritiTM 96型PCR扩增仪， GelLogic 212Pro型凝胶成像分析系统。

DNA marker、Taq酶、dNTP和10×PCR buffer均购自Takara公司。ExRed核酸染料由庄盟生物提供。

1.3 实验方法

1.3.1 猫基因组DNA的制备：

参照《分子克隆指南》[19]及Loparev VN[20]等所提出的方案，用NaI手提法提取血凝块基因组DNA，具体步骤详见李芳芳等[21]采用的血凝块手提法。

提取后的基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用微量分光光度计测定其浓度和纯度。最后将DNA适量稀释成50～100 ng/μL作为DNA模板，于4℃保存备用。

1.3.2 微卫星DNA位点的选择与引物的合成

本课题组根据Lipinski等[22]推荐的9个位点，衣帅等[23]人选出的用于华北制药厂虎皮猫遗传检测的31个微卫星位点，以及从GeneBank中筛选出的一些位点，共计74个微卫星作为本次实验的备选位点。引物委托上海生工有限公司合成。

1.3.3 PCR及琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增选用20 μL的反应体系，其中：10×PCR buffer(Mg2+Plus)2 μL, dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL, 上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，模板(50～100 ng/μL)1 μL，灭菌水(ddH2O)13.8 μL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s；72℃延伸30 s；35个循环；72℃延伸7 min；用2.5%的琼脂糖、电压120 V、30 min，ExRed(1 μg/mL)染色，电泳PCR产物，进而筛选出扩增效果好的产物进行STR扫描。

初选的退火温度是参考相关文献或引物合成公司推荐的退火温度，挑选扩增效果不好的引物进行退火温度的梯度优化。

1.3.4 STR扫描

首先在ABI3730XL DNA测序仪上(Applied Biosystems,Inc.)将PCR产物进行毛细管电泳分型，并通过GeneMapper4.0(Applied Biosystems,Inc.)软件判读每个位点各等位基因对应的扩增片段大小，随后，用自主编写的软件将每个位点等位基因的扩增片段从小到大排序为01、02、03、04等，之后将每个样本的基因型转为0101、0203、0202、0103等形式(无扩增条带的样本基因型记为0000)。

1.4 统计学方法

每个样本的基因型转为0101、0203、0202等形式后输入在线软件Genepop，对各位点进行Hardy-Weinberg平衡分析并检测杂合子缺失情况。并用该软件的类型转换功能将每个样本的基因型转换为 PopGen1.32软件所需格式。PopGen1.32可计算观测等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度等指标。

2 结果

2.1 基因组DNA琼脂糖检测结果

将NaI手提法提取的基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统拍照后的电泳图显示，DNA条带清晰、明亮、无明显拖尾现象(如图1所示)，满足该实验要求。

2.2 PCR反应中退火温度的优化结果

以初选的退火温度进行两个样本的PCR反应时，有56个位点得到了有效扩增，另有18个位点的凝胶电泳图存在条带模糊、有非特异性扩增或者没有目的条带扩增等现象，本研究针对这18个位点的退火温度进行了梯度优化。13个位点优化后扩增出了理想条带；有4个位点的扩增效果变化不明显；另有1个位点经退火温度优化后仍没有扩增出目的条带。图2为FCA1264、FCA996两位点的退火温度优化电泳图。

注：编号S1～S6为暹罗猫DNA；编号D1～D6为家猫DNA。图1 部分猫基因组DNA的1%琼脂糖凝胶电泳图Note. S1->S6: Numbers of Siamese cat genomic DNA; D1->D6: Numbers of domestic cat genomic DNA.Figure 1 1% Gel electrophoretogram of cat genomic DNA

注：M为marker，分子量从大到小依次为500、400、300、200、100 bp。图示编号为PCR反应时所用退火温度(℃)。1～5泳道所用引物为FCA1264；6～10泳道所用引物为FCA996。图2 FCA1264、FCA996位点的退火温度梯度优化电泳结果Note. M is the marker (500, 400, 300, 200, and 100 bp). Numbers represent annealing temperatures (°C). The former five temperatures were used for the FAC1264 locus, and the later five temperatures were used for the FAC996 locus.Figure 2 Annealing temperature gradients of FCA1264 and FCA996 loci

2.3 微卫星位点的初步筛选结果

备选74对引物的PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳后，其中41对引物(占总数的55.41%)可检测到个体间等位基因的多态性，有15对引物(占总数的20.27%)的扩增产物为单态，8对引物的扩增产物为非特异性条带，10对引物尚得不到稳定扩增。图3为FCA221位点扩增产物的电泳图谱。

2.4 STR扫描结果

本实验通过毛细管凝胶电泳进行了基因分型，成功分型率为97.3%。PCR扩增产物进行STR扫描时，会出现两种情况的波形，判读方法如下：若样品为杂合子，则有两个独立的主峰(如图4)；只有一个主峰的样品为纯合子(如图5)。可依照峰面积的大小判断主峰。图4、图5的横坐标表示扩增产物的片段大小。图中所示峰值越高，表示该产物片段量越多。

注：M为marker，分子量从大到小依次为500、400、300、200、100 bp；序号1～10为暹罗猫，序号11～26为家猫。图3 FCA221位点PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱Note. 1-10: M represents the marker (500, 400, 300, 200, and 100 bp). 1-10: Numbers of Siamese cats; 11-26: Numbers of domestic cats.Figure 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products from the FCA221 locus

注：第10号猫的等位基因大小为145 bp和173 bp，属于杂合子。图4 FCA221位点在图3对应的10号猫STR扫描结果Note. The alleles of cat 10 were 145 and 173 bp, which were heterozygous.Figure 4 STR scanning at the FCA221 locus in cat 10

注：第11号猫的等位基因大小为173 bp，属于纯合子。图5 FCA221位点在图3对应的11号猫STR扫描结果Note. The allele of cat 11 was 173 bp, which was homozygous.Figure 5 STR scanning at the FCA221 locus in cat 11

2.5 最终筛选的微卫星位点结果

经两种方法逐步筛选备选的74对引物时，共得到55个富含多态性的微卫星位点。在猫的每条常染色体(除了A1、B1染色体)上适当选择1～2个多态性较高的STR位点，并最终选取了31对扩增效果较好、多态性较高的微卫星引物，作为实验用猫遗传质量检测的一套引物。表1为筛选的31个微卫星位点对应的编号、染色体位置、等位基因范围、退火温度等相关信息。终选的31个引物在猫群体中的扩增条带范围为124～385 bp，所用退火温度范围为55℃～60℃，共检测出261个等位基因，各位点的等位基因数5～20个不等，平均等位基因数为8.42。

3 讨论

众多实验结果[24-27]表明，本课题组所选用的STR标记多态性高，呈共显性，等位基因的变化幅度小，易实现PCR扩增和凝胶电泳。在收集样本时，可选用非损伤方式获得，提取的DNA纯度要求不高。因此，微卫星具有很强的实用性，属于遗传质量检测的优选标记。微卫星标记的获得方式有四种：1)通过检索DNA序列数据库获得STR；2)借助与所研究物种亲缘关系较近的物种寻求STR；3)从构建的基因组文库中筛选含STR的阳性克隆；4)利用RAPD标记获取STR。本次实验选用第一种方式获得微卫星标记。该方法简单易行且快速经济，但所得微卫星信息有限不如基因组文库，无法反映整个猫的基因组状况。

备选的STR在PCR扩增时有些位点存在等位基因无法扩增，非特异性扩增等现象。需要对扩增产物进行检测，从而剔除无法扩增以及非特异性扩增的位点，最终选出相对理想的高多态性STR位点。目前，国内外对筛选微卫星并没有统一的标准可寻，一般通过衡量等位基因数目取舍备选的微卫星位点[28-29]。Barker[30]在全球家畜品种间遗传距离测定草案中提供的建议具有一定的参考价值。在检测群体遗传质量时，Barker认为：1)所用的每个微卫星位点至少有4个等位基因；2)为了兼顾检测结果的准确性和经济性，所筛选的微卫星位点数不少于26个；3)位点之间不连锁，所选的位点尽量均匀分布每条染色体上。

表1 31个猫微卫星位点的相关信息Table 1 Characteristics of 31 microsatellite loci in the cats

本实验采用两种方法逐步筛选备选的74对引物。第一步选用2.5%的琼脂糖凝胶电泳初筛，根据琼脂糖凝胶电泳结果初步判定所选引物是否合适以及PCR扩增是否成功,即初步分析引物适用性。剔除无法扩增、非特异性扩增或者不能稳定扩增的位点。挑选了56个条带清晰，具有特异性扩增的位点以便进一步STR扫描。电泳时有些位点存在引物二聚体现象，但其片段小于100 bp，易与特异条带区分。初筛所用琼脂糖凝胶电泳法分离效果不是很好，难以区分小于10 bp的片段，多数STR位点的等位基因变化幅度为20～40 bp，琼脂糖凝胶最多仅能检出3～4个等位基因。理论上可通过增加琼脂糖凝胶的浓度提高分离效果，但浓度太高不易灌制凝胶，无法提高分辨率。但琼脂糖凝胶电泳省时省力经济，不失为初筛引物的有效方法。随后，将挑选的56个位点进行STR扫描。STR扫描属于一种新型的基因分型技术，不仅能有效判读样品的纯合和杂合状况，还可以将相差1 bp的DNA片段区分开，准确测定等位基因的片段大小。该方法灵敏度高、操作简单、易实现高通量检测，但在检测前要求荧光标记引物，检测成本较高。本实验采用琼脂糖凝胶电泳初筛后再进行STR扫描可适当降低成本。本实验综合考虑扩增条带的特异性、清晰度、稳定性以及微卫星位点在个体间的多态性，共得到55个富含多态性的微卫星位点。为了兼顾遗传检测成本和准确性，本实验在猫的每条常染色体(除了A1、B1染色体)上适当选择1～2个多态性较高的STR位点。最终获得了31对扩增效果较好,多态性较高的微卫星引物，推荐为实验用猫遗传质量检测的一套首选引物。但筛选的位点是否完全适合用于实验用猫的群体遗传检测，尚需在实践中应用验证。此外，由于实验所用样本数量有限，还不能完全代表猫的多态性。在今后实践中，应增加不同来源的猫品种样本量，发掘新的多态性位点，以确保准确描述实验用猫的遗传质量。