氨基葡萄糖盐酸盐及其衍生物对斑马鱼骨骼损伤修复的比较研究

张文娟，许璟瑾，姚丽云，李秀敏，潘裕添，薛 钰,2*

(1.闽南师范大学福建省菌类活性物质工程技术研究中心， 福建 漳州 363000；2.膜生物学国家重点实验室，北京 100101)

氨基葡萄糖盐酸盐(glucosamine hydrochloride，GAH)又名葡糖胺盐酸盐，是天然氨基单糖衍生物之一，而氨基葡萄糖是软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分[1-2]。前期的研究结果表明， GAH对斑马鱼骨骼的发育及损伤有明显的促进及修复作用。

而与GAH有类似结构的糖类及衍生物有很多，如：葡萄糖(glucose，Glu)；葡萄糖的同分异构体D-半乳糖(D-Galactose，Gal)；由葡萄糖的同分异构体甘露糖加氢而得到的甘露醇(manntiol，Man)；与GAH类似的氨基糖衍生物N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，NAG)[3-5]。本文以斑马鱼为模型，探索比较GAH及其衍生物对斑马鱼幼鱼骨骼损伤修复及预防的效果。

1 材料和方法

1.1 实验动物

TU品系斑马鱼，由清华大学生命科学学院孟安明课题组惠赠。饲养于本课题组的斑马鱼水循环养殖系统中，斑马鱼的养殖和繁殖参照标准方法[6-7]。将性成熟(3月龄)的雌雄斑马鱼放入交配缸中，插入隔板；次日清晨拨开挡板待交配产卵，斑马鱼胚胎在受精后30 min内收集，洗涤后放入90 mm培养皿，加入Holfreter水(0.05 g/L KCl，0.1 g/L CaCl2，0.025 g/L NaHCO3，3.5 g/L NaCl)培养于28℃恒温培养箱中，在体式显微镜下挑选发育正常胚胎，用于试验。动物实验遵循3R原则。

1.2 实验药物及仪器

本研究所用GAH药物是从双孢蘑菇中提取所得，与传统从虾蟹壳来源相比，避免了过敏、呕吐等不良反应，扩大了适用人群。葡萄糖和甘露醇(AMRESCO)；D-半乳糖溶液(国药集团)；N-乙酰葡萄糖溶液(上海源聚生物科技有限公司)；阿仑膦酸钠片(默沙东制药)；枸橼酸铁铵(Sigma，F5879-100G)。

AUY320日本岛津电子分析天平(上海仪田精密仪器有限公司)；PYX-280-A生化培养箱(科力仪器有限公司)；ZD-9550转移摇床(海门其林贝尔)；MS-H-S磁力搅拌器(武汉华科达实验设备有限公司)；Nikon SMZ18体式荧光显微镜(日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 胚胎的药物处理

以6孔板为实验容器，每孔50枚胚胎，根据前期的实验条件及已有的研究报道[8]，选用0.1%(1 mg/mL)的工作浓度，将斑马鱼受精后0.75 h的胚胎分别暴露在葡萄糖溶液(Glu)、甘露醇溶液(Man)、D-半乳糖溶液(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺溶液(NAG)和GAH溶液中，以未加药组即Holfreter水培养为对照，每个处理组至少50枚胚胎，每12 h更换一次溶液，同时设置3个平行样。观察斑马鱼胚胎发育到36 h的生长状况及死亡情况。

1.3.2 阿尔新蓝和茜素红染色

阿尔新蓝染色是一种能够特异性地染色软骨细胞胞外基质的染料，发育生物学研究中一般使用该染色方法检测胚胎骨骼的形成和软骨的发育情况[9-10]。茜素红能与骨骼中钙离子以螯合方式形成复合物，可识别骨的钙盐成分，与骨中的钙结节产生显色反应，因此可用来检测鱼的骨形态和骨密度[11]。阿尔新蓝和茜素红染色方法参照文献[12]。染色完成后，观察斑马鱼骨骼的修复状况，并拍照记录。

1.3.3 不同药物对斑马鱼骨质疏松症的修复作用分组

收集48 hpf(hours post-fertilization)的斑马鱼幼鱼，分为对照组(WT，正常的养鱼水培养至第10天)；FAC组(500 μg/mLFAC培养至第10天)；Man组(FAC培养4 d，再换成0.1%甘露醇溶液培养4 d)；Glu组(FAC培养4 d，再换成0.1%葡萄糖溶液培养4 d)；NAG组(FAC培养4 d，再换成0.1% N-乙酰葡萄糖胺溶液培养4 d)，Gal组(FAC培养4 d，再换成0.1%半乳糖溶液培养4 d)；GAH组(FAC培养4 d，再换成0.1% GAH培养4 d)，共7组。对培养10 d的7组幼鱼进行阿尔新蓝染色和茜素红染色。

1.3.4 GAH和阿伦膦酸钠对骨质疏松症的预防作用分组

收集24 hpf的斑马鱼胚胎，分成 4组，分别为对照组(CTR)：正常的养鱼水培养至第10天；CTR+FAC组：先用H2O培养5 d，再用500 μg/mLFAC培养4 d；AL+FAC组：先用0.1%AL培养5 d，之后用FAC培养4 d；GAH+FAC组：先用0.1% GAH培养5 d，再换成FAC培养4 d。对培养10 d的4组进行茜素红染色。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 相同浓度下不同药物对斑马鱼胚胎发育的影响

与对照组相比，半乳糖与N-乙酰葡萄糖胺溶液的斑马鱼胚胎死亡率最高，且发育有明显的延缓；葡萄糖与甘露醇对斑马鱼胚胎的影响较小，与对照组的死亡率基本相同，发育速度正常；GAH的死亡率为22%，发育正常且一致。总体分析对斑马鱼胚胎发育影响的大小依次为葡萄糖<甘露醇

图1 相同浓度的不同样品对斑马鱼胚胎死亡率的影响(n≥50)Figure 1 Embryo mortality rate at the same concentration of various agents

2.2 不同药物对斑马鱼骨质疏松症的修复作用

2.2.1 对软骨损伤的修复比较

通过阿尔新蓝染色检测不同处理组的软骨发育状况，与FAC组相比，Man组和Glu组染色基本一致，其骨骼染色没有变化；Gal组和NAG组，在副蝶骨、角舌骨、腭方骨及角鳃骨等部位的染色与Glu组和Man组相比加深，且Gal组比NAG组的染色更深；而GAH组的整个头部骨骼染色明显加深，与对照组较为接近。(图2a～g)

统计分析结果显示，Glu组、Man组、NAG组的染色面积与FAC组相比差异无显著性(P> 0.05); Gal组的染色面积显著性增加(P< 0.01); GAH组的染色面积极显著增加(P< 0.001)，表明GAH对斑马鱼软骨的损伤修复效果最好。(图2 h)

注：(ch)角舌骨；(ps)副蝶骨；(mk)麦柯耳软骨；(hm)舌骨下颌弓；(pq)腭方骨；(cbr1-5)角鳃骨；(op)孔盖；(nc)脊索；(ot)耳石。与FAC组比较，**P< 0.01，***P < 0.001。图2 不同糖类对FAC诱导的骨质疏松模型斑马鱼软骨的修复作用(Bar=100 μm)Note. ch: Ceratohyal; ps: Parasphenoid; mk: Meckel’s cartilage; hm: Hyomandibula; pq: Palatoquadrate; cbr1-5: Ceratobranchia; op: Operculum. nc: Notochord. ot: Otolith.Compared with the FAC group，**P< 0.01 and ***P < 0.001.Figure 2 Effect of various agents on the cartilage developmental defects induced by FAC

2.2.2 对硬骨损伤的修复比较

通过茜素红染色观察骨密度及骨形态，结果表明：与FAC组相比，Man组和Glu组的基本一致，染色都在其头部的脊索和匙骨稍有加深；Gal组与NAG组的副蝶骨、角舌骨、麦柯耳软骨及匙骨等部位的颜色比Glu组和Man组深；而GAH组的恢复效果最为显著，整个头部的骨骼染色与对照组接近，并且明显能看到两节脊椎。(图3 a～g，)

统计结果显示，与FAC组相比，Glu组、Man组、NAG组的染色面积无显著性差异(P> 0.05); Gal组的染色面积显著性增加(P< 0.01); GAH组的染色面积极显著增加(P< 0.001)。

骨密度的变化趋势与染色面积的变化趋势一致。由此说明，GAH对斑马鱼的骨骼损伤修复效果最好，同时，在后期药物修复的过程中，GAH组死亡率为零，而Gal组与NAG组陆续出现死亡，侧面反映了GAH的药效温和。(图3 h～i)

2.3 不同药物对骨质疏松症的预防作用

与CTR组相比，其它三组的染色深度有不同程度的减弱。CTR+FAC组中的副蝶骨和脊索的染色信号显著减弱；匙骨、孔盖和鳃条骨等部位的染色区域也明显减小。AL+FAC组的斑马鱼头部染色整体变浅，染色面积也显著减少，且有明显的残留药物(FAC)，只有匙骨、脊索和孔盖可见染色信号。而在GAH+FAC组中的麦柯耳软骨、软骨内成骨、孔盖、鳃条骨、舌骨下颌弓和脊椎骨都清晰可见，尤其是匙骨和脊索的染色强度与对照组非常接近，说明经GAH处理后，可明显减缓FAC引发的骨损伤。(图4)

3 讨论

斑马鱼是一种优良的骨骼研究动物模型，它与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，与其他的动物模型相比，具有个体小适合高通量化学筛选、幼鱼身体透明易于观察骨骼发育的特点，所以近年来以斑马鱼为模型的骨骼研究逐渐成为这一领域的热点[16-17]。斑马鱼的骨骼发育是一个从头到尾的进程，其整个脊椎发育完成需要23 d左右。本研究对发育至第10天的斑马鱼幼鱼进行骨骼染色，此时其颅骨已基本形成，脊椎应发育至第9脊椎，当用药物(FAC)处理后，本该在此时期形成的骨骼出现缺失，导致一系列检测指标下调，与Zhang等[18]报道的骨质疏松症表型一致。

实验结果表明，对斑马鱼胚胎发育影响的大小依次为：葡萄糖<甘露醇

GAH对FAC引起的损伤有一定的预防作用，优于阿仑膦酸钠片。同时，在AL+FAC组处理过程中出现了较高的死亡率，且后期染色有明显残留物，说明在正常状态下服用阿仑膦酸钠，不仅不能起到预防骨质疏松的作用，反而对正常的机体有损害，此结果为未来GAH作为保健品开发，用于骨质疏松预防提供了初步的实验支撑。

注：(a～g)斑马鱼头骨染色的腹面观；(a’～g’)斑马鱼头骨染色的侧面观；(mk)麦柯耳软骨；(hm)舌骨下颌弓；(op)孔盖；(cl)匙骨；(ps)副蝶骨；(oc)枕骨;(ch)角舌骨；(bs)鳃条骨；(ot)耳石；(nc)脊索；(spine)脊椎骨。与FAC组比较，**P< 0.01，***P < 0.001。图3 不同糖类对FAC诱导的骨质疏松模型斑马鱼骨骼修复作用的比较(Bar=100 μm)Note. (a-g) Ventral view of alizarin red stained 10 dpf zebrafish larvae (left column). (a′-g′) Lateral view of alizarin red stained 10 dpf zebrafish larvae (right column). Note. mk: Meckel’s cartilage; hm: Hyomandibula. op: operculum; cl: Cleithrum; ps: Parasphenoid. oc: Occipital; ch: Ceratohyal; bs: Branchiostegal; ot: Otolith; nc: Notochord. Compared with the FAC group， **P< 0.01 and ***P < 0.001.Figure 3 Effect of the various agents on bone developmental defects induced by FAC in larvae

注：(mk)麦柯耳软骨；(en)软骨内成骨；(ps)副蝶骨；(nc)脊索；(cl)匙骨；(op)孔盖；(spine)脊椎骨；(bs)鳃条骨；(hm)舌骨下颌弓。图4 GAH对骨质疏松的预防作用(Bar=100 μm)Note. Note. mk: Meckel’s cartilage; en: Entochondrostosis; ps: Parasphenoid; nc: Notochord; cl: Cleithrum; op: Operculum; bs: Branchiostegal; hm: Hyomandibula.Figure 4 Preventive effect of GAH on osteoporosis