Jagged 1在辐射诱导肺纤维化中的作用

来志扬,魏仲航

(吉林大学中日联谊医院 1.放射线科；2.急救医学科，吉林 长春130033)

Jagged1(JAG1)可以调节诸多细胞表型，并在辐射诱导的肺纤维化过程中发挥重要作用，在肺损伤发展过程中，血管周围成纤维细胞中的Notch被激活，激活的Notch可与JAG1结合，并抑制肺组织正常的损伤修复过程，从而促进肺纤维化的发生发展。放射性肺纤维化是放射治疗最为棘手的并发症之一。如何减少放射性肺纤维化的发生、减轻肺纤维化程度，以增强放疗的效果已经成为肿瘤放射治疗的一个热点。了解掌握JAG1在肺纤维化发生、发展中的分子机制，对防治肺纤维化，减少并发症的发生具有重要意义。本文对JAG1在放射性肺纤维化中作用的分子机制及治疗进展进行综述。

哺乳动物有4种Notch受体(Notch1-4)和5种Notch配体(Delta-like1/3/4，Jagged1/2)。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过3次剪切，由胞内段(NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES、HEY等碱性螺旋转录抑制因子家族的靶基因，发挥生物学作用[1-3]。

肺部受到辐照或化学药物损伤过程中，成纤维细胞产生的少量基质可以促进损伤修复，但当产生基质过多的时候，就可以形成瘢痕或纤维化。所以成纤维细胞是纤维化形成过程中的核心细胞[4,5]，在肺损伤修复过程中同样发挥至关重要作用。Notch-JAG1主要作用是调节肺细胞的表型，从而发挥生物学功能，包括调节肺动脉细胞、支气管平滑肌细胞，所以Notch-JAG1可能在肺成纤维细胞中也有调控作用[6,7]。

1 材料与方法

1.1材料人肺成纤维细胞系HLF购于美国模式培养物集存库(ATCC)；DMEM培养基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国Gibco；siRNA-JAD1购于中国苏州吉玛基因。α-SMA、Collagen-1、JAG1单克隆抗体购于美国Abcam；MTT试剂盒购于博士德生物有限公司。

1.2细胞分组常规复苏HLF细胞，将细胞接种于含有1%双抗+10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件37℃、5%CO2恒温培养。收集对数生长期的HLF细胞并接种于4个10 cm培养皿中，调整细胞融合率为50%左右，分为4组，即对照组(control)、照射组(IR)、siRNA抑制组(siRNA-JAG1)、抑制+照射组(siRNA+IR)，抑制组和抑制+照射组转染siRNA-JAG1，转染后24 h，照射组与抑制+照射组进行10Gy X-Ray辐照随后进行后续实验。

1.3蛋白表达检测

收集各组细胞并提取总蛋白，测定每组蛋白浓度，取适量样品行Western Blot凝胶电泳实验，转至硝酸纤维膜，将膜置于10%牛奶的封闭液中，室温封闭2 h，分别加入α-SMA、Collagen-1、JAG1单克隆抗体(1∶1 000)置于4℃过夜，二抗(1∶10 000)室温2 h，按ECL试剂盒说明进行电化学发光检测。

1.4mRNA水平检测

收集各组细胞并提取总RNA，测定每组RNA浓度，用takala逆转录试剂盒将得到的RNA逆转录成cDNA，按照常规实时定量荧光PCR方法进行检测，得到的cq值通过统计方法进行转换，最终以△△CT形式进行统计分析做图。

1.5细胞增殖活性检测

收集各组细胞，将细胞置于37℃、5%CO2恒温培养，分别培养24 h、48 h、72 h时，离心弃掉上清液每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，持续培养4 h，离心弃上清，加入DMSO每孔100 μl，震荡至结晶物充分溶解，采用全自动酶标仪检测450 nm处吸光值(OD值)并做图统计。

1.6统计学方法采用SPSS20.0对数据进行统计学分析，每组数据间采用独立样本T检验法分析数据，计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1成纤维细胞辐照后JAG1及肺纤维化相关标志物表达情况

为确定JAG1是否与辐射诱导的纤维化相关，我们检测了HLF细胞辐照后24 h、48 h、72 h后，JAG1、α-SMA、Collagen-1的蛋白和mRNA表达情况。通过以上检测我们发现辐照后随着时间的延长，JAG1蛋白表达逐渐增高与mRNA表达一致，(P<0.05)并具有统计学意义(见图1A、B)。与此同时平滑肌动蛋白α-SMA和胶原蛋白1(Collagen-1)的蛋白与mRNA表达也升高(P<0.05)，与JAG1形成正相关。

(1A为Western Blot法检测结果；1B为qPCR法检测实验结果)

2.2抑制成纤维细胞中的JAG1可抑制肺纤维化

为确定是否抑制JAG1可抑制辐射效应减弱肺纤维化，我们首先设计了JAG1基因的干扰片段(siRNA-JAG1),在三个干扰片段中，通过蛋白和mRNA表达水平的检测我们选取了干扰效果最好的siJAG1-1片段(见图2A、B)。在成纤维细胞中瞬时转染JAD1的干扰片段24 h后对其进行10Gy的X射线辐照，结果显示，与单独辐照组相比，转染+照射组α-SMA表达显著下降，说明成纤维细胞并未被激活，没有向肌成纤维细胞转化，Collagen-1的表达同样明显被抑制，说明JAG1的抑制会减少细胞外基质(ECM)的过度堆积，从而缓解纤维化。

注：*P<0.05，与Control组相比较；#P<0.05，与10 Gy组相比较

2.3MTT法检测细胞增殖

MTT结果显示，辐照后细胞增殖活性显著降低，转染siJAG1-1后，活性明显增强，说明抑制JAG1后可显著提升成纤维细胞对X射线的辐射抗性，降低辐射对其影响(见图3)。

图3 各组细胞增殖活性比较

3 讨论

近年来关于JAG1的研究主要集中在血液肿瘤方面，关于JAG1基因在肺纤维化中的研究鲜为人知。JAG1与Notch的结合可以调节细胞表型从而发挥生物学功能。同时JAG1可影响多条信号通路如TGF-β/Smads，Wnt/β-catenin，以及PI3K/AKT信号通路等[8-10]，这些信号通路多数均参与肺纤维化进程中的一部分。

我们目前的研究表明，JAG1的蛋白与肺纤维化重要标志物之间是负相关的。体外研究中发现，随着辐照后时间的延长，成纤维细胞活化标志物α-SMA逐渐表达增强，表明辐照后成纤维细胞被活化，向肌成纤维细胞转化[11]。随后我们检测了细胞外基质(ECM)中的主要成分Collagen-1，结果表明辐照后Collagen-1同样呈逐渐增强趋势，表明ECM大量集聚，最终产生了纤维化(见图1)[12]。前期实验证明JAG1与肺纤维化重要标志物呈正相关，说明JAG1参与到辐射诱导的肺纤维化过程中，为研究JAG1在肺纤维化中的具体作用，我们设计了JAG1的小分子RNA干扰片段，实验证明干扰效果良好。随后我们对成纤维细胞进行了JAG1的抑制，检测发现，JAD1被抑制后肺纤维化标志物α-SMA、Collagen-1同样被抑制。同时，JAG1抑制后可明显降低辐射诱导的纤维化标志物的升高(见图2)，说明JAG1在肺纤维发生过程中发挥了重要的促进作用，抑制JAG1可降低辐射效应，提高成纤维细胞的辐射抗性，阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并阻止ECM的聚集，从而缓解纤维化。接下来，为研究JAG1的降低是否对辐射导致成纤维细胞损伤产生影响，我们利用JAG1低表达的成纤维细胞进行辐照，检测成纤维细胞的增殖活性。结果显示，辐照可导致细胞损伤降低成纤维细胞增殖活性，而抑制JAG1后，成纤维细胞增殖活性显著上升，表明JAG1可缓解辐射损伤，增强成纤维细胞的辐射抗性。至此我们得出结论，JAG1参与辐射诱导的肺纤维化过程，并且抑制JAG1可显著降低辐射诱导的肺纤维化降低辐射对成纤维细胞的损伤。

综上所述，抑制JAG1可调控肺纤维化过程，并降低辐射对成纤维细胞的损伤。但实验仍有不足，辐照后成纤维细胞中JAG1是否会通过其他下游靶基因参与肺纤维化过程仍有待进一步深入研究。