IL-21对慢性丙肝患者分泌IL-17和IFN-γ的调节作用

朱兵帅，朱明武

(1.漯河市中心医院 检验科，河南 漯河462000；2.新乡医学院第一附属医院 检验科，河南 卫辉453100)

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，是导致肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素[1]。据WHO统计，全球HCV的感染率约为3%，约2亿人感染了HCV，每年新发病例约3.5万例，严重危害着患者的生命健康，已成为严重的社会和公共卫生问题。据报道，宿主对HCV感染的免疫反应异常是HCV感染的重要发病机制，细胞因子在丙型肝炎免疫调控和免疫损伤中的作用越来越引起人们的重视[2-4]。Th1细胞分泌TNF-β、IFN-γ、IL-12等细胞因子，可以激活细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，增强机体清除病毒及感染的能力。Th17细胞是近年来新发现的Th亚群，能分泌重要的炎症介质，如IL-27、IL-22等。本课题组拟先观察慢性丙肝患者血清中的IL-12、IL-17、IFN-γ等的表达情况，然后再提取慢性丙肝患者PBMCs，进行IL-21体外刺激，检测IFN-γ、IL-17蛋白的表达变化，进一步探讨IL-21对慢性丙肝患者的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1研究对象

2016年10月-2017年12月本院就诊的HCV-IgG、HCV-RNA均阳性的慢性丙肝患者58例，为病例组，其中男27例，女31例，年龄28-47岁，所有的入围患者均符合慢性丙肝诊断标准。对照组：无偿献血者50例，其中男25例，女25例，年龄20-54岁，肝炎标记物均为阴性，肝功能正常。随机从病例组和对照组的研究对象中各选取20例，其中男女各10例，提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。所有研究对象均知情同意，不同分组间的年龄、性别均无显著性差异。

1.2研究方法

1.2.1血清细胞因子的检测 所有入围者空腹采集血液标本3 ml，分离血清，-80℃保存，通过酶联免疫分析法(ELISA法)集中检测IL-12(试剂盒购自上海西唐生物科技公司)、IL-17(试剂盒购自美国R&D公司)、IL-18和IFN-γ(试剂盒购自上海森雄科技实业公司)，严格按试剂盒说明书进行检测和分析。

1.2.2PBMCs的提取与培养 采集5 ml肝素抗凝静脉血，2 h内使用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque试剂购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司)通过密度梯度离心法分离PBMCs，PBS洗涤2次，以RPMI1640(含有10%小牛血清)调配成2×106/ml的细胞悬液，接种于24 孔培养板，每份标本接种6个孔，每孔1 ml，每孔含有PBMC 1×106个。

1.2.3PBMCs的分组培养 具体的分组情况：①无偿献血者的PBMCs组(正常组)；②IL-21与无偿献血者的PBMCs共培养组(正常+IL-21组)；③慢性丙肝患者的PBMCs组(丙肝组)；④IL-21与慢性丙肝患者的PBMCs共培养组(丙肝+IL-21组)。先在③组和④组的24孔板中加入25 mg/L丝裂霉素，处理1 h后，再把10 μg/L 的IL-21加入到②组和④组的24孔板中。每孔均加入1 mg/L的植物血凝素(PHA)，混匀后于37℃、CO2培养箱培养。培养72 h后收集24孔板中的上清液，通过ELISA法集中检测IL-17和IFN-γ水平。

2 结果

2.1慢性HCV感染者血液中的Th1/Th17类细胞相关细胞因子的表达情况

与健康献血者相比，慢性HCV感染者血清IL-12和IFN-γ表达水平明显降低(P<0.05)，IL-17明显增高(P<0.01)，IL-18无显著的变化,见表1。

表1 慢性HCV感染者与对照组血清IL-12、IL-17、IL-18和IFN-γ的比较

注：组间比较，aP<0.05，bP<0.01。

2.2IL-21对慢性丙肝患者PBMCs分泌IL-17、IFN-γ的调节情况

IL-21可以调节PBMCs分泌IL-17、IFN-γ，但影响慢性丙肝患者分泌IL-17效果更明显，促进PBMCs分泌IL-17水平(约3.5倍)明显优于IFN-γ(约2倍)，见表2。

表2 IL-21诱导不同人群PBMCs分泌IL-17和IFN-γ的情况(pg/mL)

注：与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01。

3 讨论

HCV 感染后，多数患者可以发展为慢性丙型肝炎。在HCV慢性化过程中，HCV 可以引发机体免疫损伤，Th细胞亚群(如Th1/Th2的平衡调节)和细胞因子网络失衡对慢性丙型肝炎的进展起着重要的作用[5,6]。Th17细胞是不同于Th1/Th2的另一个Th细胞亚群，主要分泌IL-17等细胞因子，可与IL-6、TNF-α、IFN-γ等细胞因子发挥协同效应，调节固有免疫和细胞免疫，促进炎症的发生[3,7]。本研究发现，慢性丙型肝炎IL-17水平水平明显高于正常对照组，说明IL-17在慢性丙型肝炎致病中起着重要作用。对于HCV的免疫治疗，既要有效调动体内免疫杀灭病毒，同时也要避免过度免疫反应而损伤自身的正常细胞。

IL-21是一种具有免疫调节作用的I型细胞因子，主要由CD4+T和活化的NKT细胞分泌，与细胞表面的受体结合后可以分泌细胞因子、炎症因子和趋化因子等，在病毒免疫和治疗中可发挥重要作用[8]。Feng等[9]研究发现，HCV、HIV感染者CD8+T细胞杀伤作用减弱，IL-21可增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性，促进Tfh细胞、Th17细胞增殖，负调Treg细胞的免疫抑制作用。Attridge等[10]发现，IL-21通过激活STAT-3信号通路，上调RORγt的表达，从而使记忆性CD4+T细胞分化为Th17细胞，Th17细胞活化后分泌IL-17等细胞因子，从而导致自身免疫性疾病。本研究发现，IL-21刺激正常人群和慢性丙肝患者的PBMCs后，分泌IL-17、IFN-γ水平均增高，但慢性丙肝患者IL-17的增速(约3.5倍)远高于IFN-γ(约2倍)。IFN-γ主要由活化T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)产生，具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。本研究发现，慢性丙肝患者血清IFN-γ水平降低，IL-21刺激PBMCs后，IFN-γ分泌的增速远不及IL-17。由于IFN-γ主要来源于Th1细胞，IL-17主要来源于Th17细胞，推测IL-21可能也参与了Th1/Th17的平衡调节，有待于从细胞水平继续研究。总之，IL-21的存在有助于控制HCV病毒的发展，降低肝细胞损伤。