CSRP1蛋白在大肠癌中的表达及意义

石 宇，王宇博,谢 风，何成彦，师庆红

(吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春130033)

富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白质(CSRP)家族是一组由两个串联排列的LIM结构域与短的富含甘氨酸的区域相连的蛋白质[1]。到目前为止，CSRP家族中的三个成员(CSRP1，CSRP2和CSRP3)已被证实在脊椎动物中表征，并且展示了具有独特双重亚细胞定位的组织特异性分布。其中，CSRP1已经在富含平滑肌的各种器官中检测到高表达[2]。本研究旨在探讨CSRP1在大肠癌及癌旁组织中的表达情况，研究其差异，探究其与肿瘤发生、发展之间的关系，为临床诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

遴选吉林大学中日联谊医院近两年内已确诊大肠癌患者17例，取新鲜癌组织及距其边缘10 cm以上的癌旁正常组织标本，取材后立即液氮速冻，-80℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

于GE公司(美)购入DTT、SDS、TMED、SDS，于西格玛公司(美)购入RNA酶、DNA酶、尿素，于Beyo-time公司购入PMSF、考马斯亮蓝-G250，于Bio-Rad公司购入蛋白质定量试剂盒，于赛摩-菲舍尔公司购入LTQ XL离子肼质谱仪。

1.3 方法

1．3．1提取样本总蛋白，检测其浓度 打开低温冰箱取出样本，将80 mg样本组织与液氮混合，研磨充分，至其全部粉碎成匀浆。将研磨后样本以12 000 g离心1 h(温度 控制在4℃左右)，取离心后上清液体备用。考马斯亮蓝染色后，在595 nm下检测吸光度，确定蛋白浓度。检测结束后，将液体分装，放入-80℃冰箱保存备用。

1．3．2水解样本蛋白，制备多肽混合物 于低温冰箱中取出样本，于室温静置，待其温度平衡后，应用NH4HCO3稀释上述样本以达到降低尿素浓度的目的。加入适量DTT，充分混匀，确保其最终浓度在20 mmol/L。将制备好的样本放于56℃避光保存1 h。完成上述操作后，将反应温度调整至室温，应用适量IAA调整最终浓度至50 mmol/L，于避光处静置30 min。加入1∶50固定比例的胰酶：蛋白，37℃水浴过夜。将酶切产物置于-80℃保存。

1．3．3应用液质联用技术鉴定分析多肽混合物 将样品溶解于Buffer A，每次取出50 μg上样分析，将制得的多肽放入LTQ XL质谱仪中进行分析，挑选恰当的核质比检测区间，应用数据依赖方式进行质谱扫描。得到的质谱图用Bio-works3.3.1SP1软件的SEQUEST算法分析处理，用Uniprot-sprot数据库查询，对差异蛋白进行比较。

1．3．4Western Blot分析 将CSRP1作为目标蛋白，应用免疫印迹试验验证，确定CSRP1蛋白在大肠癌组织和癌旁正常组织中的表达情况。试验应用ABGENT公司(美)采购的CSRP1单克隆抗体，内参为β-actin。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 液质联用技术对样本蛋白酶解产物的分析

本试验旨在分析大肠癌组织及癌旁正常组织样本中同一蛋白质的丰度变化，若两组样本的谱图数比值>1，差值>72，则可认为其丰度有差异。遵循上述标准，分析检测结果得出大肠癌组织与癌旁正常组织共有44个差异蛋白，其中21个蛋白表达情况为上调，23个表达情况为下调。本文研究的CSRP1属于下调表达蛋白之一，其质谱图如下(图1)。

图1 CSRP1质谱图

2.2 Western Blot验证结果

Western Blot试验证实了CSRP1蛋白在大肠癌组织中和癌旁正常组织中的差异表达，其结果如下(图2) 。通过对免疫印迹试验的结果分析，可以得出CSRP1在癌组织中低表达，在癌旁正常组织中高表达的结论。

3 讨论

近年来，大肠癌发病几率越来越高。由于起病过程隐匿，患者在疾病早期并无明显症状，确诊大肠癌时已接近中晚期，这不仅加大了疾病的治疗难度，同时也降低了患者的生存率。因此，早诊断、早治疗依旧是大肠癌现阶段研究的重点。随着医学检验相关技术突飞猛进的发展，蛋白质组学对癌组织中蛋白质的表达情况、癌旁正常组织中的对比情况的研究有重要意义[3,4]。通过对比分析某种蛋白在不同组织中的差异表达，可以为临床肿瘤的诊断提供新的标志物。

图2 CSRP1免疫印迹图

富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白质1是由两个串联排列的LIM结构域与短的富含甘氨酸的区域相连的蛋白质，具有连接肌动蛋白束和α-肌动蛋白的作用，同时可以捆绑肌动蛋白微丝[5]。有研究表明，CSRP1是足体新成份之一，足体具有促进ECM(细胞外基质)降解的作用，并与细胞运动有关。蛋白质功能的发挥是由其细胞定位决定的，二者息息相关[6]。研究蛋白质在某种细胞中的定位,并且对比其在某种疾病情况下的定位对临床诊断意义重大。CSRP1是骨架蛋白之一，已有研究证实CSRP1在细胞质的表达较为明显。除此之外，CSRP1还可以抑制细胞增殖，当应激状态下诱导凋亡时，对细胞具有一定的保护作用[7]。

CSRP1已被证实在富含平滑肌的器官中高表达，其中浓度最高的是前列腺和直肠，大脑、睾丸次之，脾脏和肝脏浓度较低，肾脏最少。此外，有研究证实，CSRP1与特发性肺纤维化关系紧密，可能会增加这类患者肺癌的发病几率[8]。在肿瘤组织中，CSRP1同样存在表达失调的情况，例如乳腺癌骨转移患者和低转移骨肉瘤患者均可将其作为特征标志物，前列腺癌、肾癌组织中也出现了CSRP1的表达失调[9-12]。

本试验表明，CSRP1在大肠癌组织中的表达低于癌旁正常组织，WesternBlot试验进一步证实了大肠癌组织中CSRP1下调表达。该结果与现有研究结果一致。CSRP1在不同肿瘤组织中的表达情况差异较大，说明其与肿瘤的发展及愈后关系密切，CSRP1的作用机制还有待进一步探讨。