白及种子萌发及幼苗的微形态学观察

苏 莹， 刘珍珍， 李会宁，2*， 杨培君，2

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.为兰科白及属多年生草本植物，又名白芨，分布于我国华东、中南、西南及河北、山西、陕西、甘肃、台湾等地。白及块茎入药，具收敛止血、消肿生肌之功效，治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症[1]。近年来，中药材白及因诸多重要资源价值，已成为研究热点之一，国内外市场需求也逐年增加。由于白及种子自然萌发率不足5%[2]，野生资源因过度采挖而濒临灭绝[3-4]。目前，白及常采用营养繁殖方式开展人工栽培；组培与快繁试管苗也是种苗来源的途径，该方面的研究报道较多[3-6]。牛俊峰等[2]和史文旋等[7]开展了白及或白及种子直播育苗方法的研究。此外，组织培养条件下白及种子萌发、原球茎分化的研究也有报道。崔瑞勤等[8]采用种子组培快繁技术育苗，报道了白及种胚通过2种方式形成幼苗；而聂宁等[9]在组织培养条件下开展了白及种子萌发和原球茎发育的组织学观察，提出了具有“根状茎”等4个阶段；席刚俊等[4]在培养条件下对白及种子萌发进行了5分级描述。虽然，白及种子萌发与原球茎发育有报道，但存在表述差异和研究片段化等问题。在直播和培养状态下，白及种子萌发与幼苗形成的微形态学观察尚未见系统报道。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究利用白及成熟果实种子，在团队前期研究基础上，开展了基质直播和人工培养促白及种子萌发、幼苗形成与生长的微形态观察，总结了从种胚到幼苗的发育方式。以期通过种子繁殖，为白及开展良种选育或栽培品种复壮等种苗繁育研究提供形态学资料。

1.2 方 法

1.2.1 促萌发方法与条件

采用培养基培养和基质直播促白及种子萌发与幼苗生长两种处理。

(1)基质直播 直播基质为苔藓泥炭土(丹麦Pindstrup)∶林下腐殖土∶河沙(6∶3∶1)，经高压灭菌处理；选白及成熟饱满果实的种子，均匀散播于栽培基质上。播种后，采用MS+NAA 1.0 mg·L-1溶液均匀喷洒，之后每7 d左右用稀释4倍的溶液喷雾；透明塑料薄膜遮盖保湿，置实验室内补充光照；30 d后转常规管理。

(2)培养基培养 选成熟饱满白及果实，流水冲洗后，无菌水冲洗2次，75%酒精消毒30 s，体积分数0.2%升汞溶液消毒10～15 min，无菌水冲洗3～4次。在净化工作台中剖开果实，将种子接入萌发液体培养基中。

培养基及培养条件参考文献[6]，并加改良。液体培养基MS+NAA 1.0 mg·L-1，用于白及种子启动培养促萌发的形态学特征研究；2/3MS+香蕉20.0 g·L-1固体培养基，开展幼苗形成及生长研究。培养基中添加白砂糖20.0 g·L-1，pH 5.8；固体培养基中添加琼脂粉6.0 g·L-1。培养温度为(25±2) ℃，相对湿度80%～95%，光照12 h·d-1，光照强度约40 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 结果观察统计

观察基质直播与培养条件下，白及种子萌发与幼苗形成的过程特征；体视显微镜(Leica，M205C)和数码相机(Canon EOS 5D)拍照记录实验结果。实验数据分不同阶段取样统计和整理，在基质直播育苗盘中以对角线方式各选6个样方，1 cm×1 cm样方先后统计播种数和有效萌发数，2 cm×2 cm样方统计有效幼苗数；培养条件下，各任选6瓶样本，分别统计播种数、无效和有效萌发数、无效和有效幼苗数。实验结果使用Microsoft Excel 2007软件进行数据整理和绘图；采用t检验对平均数进行显著性检验，显著水平设为0.05。

2 观察结果

2.1 白及种子萌发

白及蒴果成熟后，显微观察其种子并未完全发育成熟，而是处于椭球形原胚状态；种子呈梭形，具膜质种皮(图版图1)。将白及种子散播于液体培养基中，种子吸水膨胀沉入底部，4 d后球形原胚开始由淡黄色逐渐变绿(图版图2)；培养9 d后绝大部分变为绿色，原胚细胞分裂增殖，尤其以环中央位细胞和顶端部分细胞分裂加快，产生突起，并撑破先端种皮，继而纵向撑裂种皮，形成近球状或椭球状的原球茎(图版图2、3)。饱满的原胚种子均能萌发，其萌发率为95.82%±2.28%(图1)。

图1 直播与培养条件下的白及种子萌发率与成苗率

采用基质播种的白及种子，大部分种子也能顺利萌发。其萌发特征与液体培养条件下的表现相似(图版图2、3)，种子萌发率为78.44%±2.45%(图1)。

2.2 原球茎分化

原球茎由胚性细胞组成，有明显的极性表现，与母体相连的种柄端，部分细胞分化为假根原细胞(图版图4、5)；而其生理学顶端产生第1枚叶原基生长点(图版图3—6、10、12、13)。培养21 d后，原球茎分化明显，顶端半圆形的叶原基生长成幼叶状，并在其对侧产生第2枚叶原基，同时在中央位形成顶芽原基(图版图11、14)；假根原细胞形成绒毛状假根；原球茎呈近球体(图版图6—9)或棒状体(图版图10、12)，种皮脱落。叶原基逐渐分化出叶鞘和叶片的幼叶(图版图11—15)，在原球茎产假根端基部或侧面产生1～2条肉质根(图版图16—19)。有的原球茎顶端产生第1枚叶原基突起后并不明显伸长生长，其中央分化生长出第2枚叶原基及生长锥(图版图20、21)。由此可见，顶端及中央位的组织细胞群在幼苗形成过程中表现出较大的贡献度。此外，有的原球茎上分化出2个以上芽(图版图22)。

培养促萌发的条件下，有部分原球茎出现白化现象，这种原球茎一般不能进一步分化而枯萎(图版图8)。在原球茎生长分化过程中，未观察到有菌根菌丝的生长(图版图10—21)。基质播种条件下，原球茎的发育速度慢于培养条件下的原球茎分化(图版图24—26)。

2.3 幼苗形成方式

白及萌发培养30 d左右，将发生明显分化的原球茎转到固体培养基中，培养后分阶段观察。幼苗形态建成类型以“原球茎—幼苗”方式，即原球茎分化形成幼苗，而未出现具节和节间的根状茎或分枝状的原球茎；其成苗率为86.49%±2.32%(图1)。其生长分化表现为顶端幼叶生长，形成2～3枚叶片，基部或侧面假根枯萎脱落，肉质不定根生长增粗，形成幼苗(图版图15—19、33)。幼苗形成过程中，第1枚与第2枚幼叶在形态上相似(图版图11、15)；但有的第1枚幼叶生长缓慢或停止生长，第1枚叶鞘和原球茎表层细胞逐渐衰退，其营养转移到发育中的幼苗(图版图16—22)。此外，有的幼苗的基部近纵向伸长，形成根茎状结构，其上产生1～3个芽苗(图版图30、31)。

基质播种条件下，幼苗的生长发育也是以原球茎直接形成幼苗的方式，原球茎或球形或棒状，幼叶叶片或宽或窄(图版图25—27)；其成苗率为55.07%±1.41%(图1)。观察发现，部分实生苗因未产生肉质根，不能从基质中充分吸收营养而使生长滞停(图版图28)；此外，在分化的原球茎和小幼苗根部，也未观察到菌根真菌的菌丝(图版图25—28)。

2.4 幼苗生长与假鳞茎形成

培养90 d后，白及试管苗迅速生长，2～3枚叶片与叶鞘伸长生长，苗基部逐渐膨大形成假鳞茎；有的假鳞茎基部可产生分枝，形成丛生苗(图版图30)；有的苗基部伸长形成肉质化的根茎状结构，其上分化产生绿色小块茎(图版图31、32)。培养190 d以后，在苗基部假鳞茎的叶鞘近轴面，以珠芽方式产生1至数个绿色小块茎，或从绿色小块茎上以“出芽”方式产生新的小块茎，形成具小块茎丛生苗(图版图34、35)。培养320 d后，小块茎膨大，绿色，直径达6～10 mm(图版图34)。培养条件下，小块茎易于发生，其产生的数量与培养基和培养时间有关。

基质播种条件下，幼苗的生长及小块茎形成较慢；当年实生苗基部膨大形成假鳞茎，一般未产生小块茎(图版图27)。

3 分析与讨论

近年来，白及种子非共生萌发与原球茎发育等方面研究虽有报道，但显复杂或混乱。有关兰科植物组培研究报道中，普遍使用的概念有“原球茎”“类原球茎”“拟原球茎”等[3-10]。其中，类原球茎(Protocorm-like body，PLB)一词是由Morel(1960)针对兰科植物茎尖等组培中产生的类似种子萌发过渡形态，即原球茎的一种特殊组织结构体提出的[10]；而原球茎(protocorm)最初指兰花种子萌发过程中的一种形态学结构体[10-11]。

3.1 白及种子具无休眠和易萌发的特性

王明君等[12]通过电镜扫描分析白及属4种种子形态特征，提出白及种子有外内2层膜质种皮，且内种皮紧贴胚乳难分离；胚微型，未分化。但不少学者[4-6,9]研究认为，白及种子具1层膜质种皮，无胚乳的原胚结构。白及种子是否存在胚乳等问题，还有待胚胎学进一步解析。本研究显示，白及种子随果实成熟后，仍处于多细胞原胚状态，而并未分化为胚；在基质播种或培养条件下，白及种胚无休眠和易萌发，而不同于国兰等其他兰科植物。但直播的萌发率不及试管培养，此与相关研究结论[7,13]相似。分析直播萌发率较低的原因之一，与原球茎的生长分化过程中缺乏充分的种胚营养供给而致缓慢或停滞有关。

3.2 白及幼苗形成方式分析

白及种子萌发至幼苗形成的方式和表述，不同研究者有不同的见解。席刚俊等[4]参照Stewart等方法，将白及种子萌发过程分为“种皮完整、种胚膨大变绿、种皮破裂(萌发)、长出第1片子叶、出现第2片子叶(幼苗)”5个阶段。这种划分指标及相关表述有待商榷。据报道[8]，白及种胚可通过两种途径形成幼苗。一种方式是种胚、淡黄色球状体、原球茎、幼苗，另一种是淡黄色球状体、根状茎、小苗；而聂宁等[9]报道，培养条件下白及种子成苗共经过“种胚、原球茎、根状茎和假鳞茎”4个阶段，组织学观察定义为“当维管束由一束分化成多束时，由原球茎阶段进入根状茎阶段”。此外，文献[11,14]综述中国兰组培指出，从原球茎或类原球茎到幼苗的发育过程分为两种类型；兰花芽培养中，出现类原球茎分化为根状茎(丛生型原球茎)或“球状—根状茎”的结构与分化。白及种子萌发与幼苗形成方式和表述的差异，分析其原因，一是组织培养中，选用的激素种类和浓度配比不同而造成的形态分化差异；二是与大多学者借用了不同兰花组培或种子非共生萌发过程的相关名词表述有关。

图版：白及种子萌发及幼苗的微形态学观察

图版说明：

1—22.试管培养条件下，白及种子萌发与幼苗生长发育过程；23—30.基质直播状态下，种子萌发与幼苗形成；31—35.固体培养下，假鳞茎苗及小块茎分化；36.白及成长植株(基地苗，花枝、果枝、地下块茎)。

1.离体种子；2.种子吸水膨胀，原球茎初期，4 d；3.种子萌动，种皮破裂；4、5.原球茎分化，种皮脱落，产假根原细胞分化及假根生长(→)，14 d；6.叶原基分化及绒毛状假根(→)，21 d；7—9.液体培养基中种子萌发，原球茎生长与分化的不同状态，21～30 d；8.部分白化的原球茎(→)；10.棒状原球茎顶端第1枚叶原基分化(→)，20 d；11.第2枚叶原基分化，35 d；12—19.近球状原球茎形成幼苗，12、13.第1枚叶原基分化(→)、生长；14.第2枚叶原基及芽原基分化(→)；15.幼叶及芽生长，叶片与叶鞘伸长；16—19.固体培养下幼苗生长发育，16.顶端第2片幼叶，基部的肉质根和残存的原球茎组织(→)，50 d；17、18.肉质不定根产生及残存组织(→)，19.完整幼苗及茎基残存的原球茎组织(→)，75 d；20、21.原球茎分化，顶端及中央位细胞群在幼苗分化中的贡献度，第2枚叶原基产生(→)，17 d液体培养；22.原球茎上产生数个芽原基；23.直播种子萌发形成原球茎14 d；24.第1枚幼叶分化生长，约20 d；25.第2枚幼叶、芽原基分化及脱落的假根与种皮(→)，35 d；26.幼苗生长，侧生肉质不定根(→)，92 d；27.直播实生苗，茎基部假鳞茎及新生肉质根(→)；28.生长滞停的幼苗(无肉质根)；29.基质直播的小幼苗；30.苗茎基部形成假鳞茎、根状茎(→)和分枝苗；31.茎基根状茎肉质化和小块茎分化(→)；32.数个绿色小块茎形成中(→)，约230 d；33.试管培养下的幼苗，50 d后；34.苗基部假鳞茎、绿色小块茎及其小块茎“出芽”增殖(→)，320 d后；35.试管小植株，苗基部膨大的假鳞茎及萌生的小块茎(→)，根状茎及丛生苗，约190 d。

3.3 白及种子萌发、幼苗生长与兰科菌根真菌的关系分析

兰科植物有两个显著特点，一是种子微小；二是种子萌发与幼苗建成过程中，依赖菌根真菌共生，或添加特定的营养物质于基质以代替菌根的作用[15]。关于共生与非共生的营养关系，也存在争议。由原球茎分化成苗后，自养型的兰科植物，对菌根真菌的营养依赖性似乎减弱，但仍然具有重要作用[16-17]。凤蝶兰种子共生萌发技术显著优于非共生萌发技术，主要表现为较高的种子萌发率和较快的发育速度[18]，从而说明，有的自养型兰科植物也可实现非真菌共生萌发。白及共生萌发包括真菌拌种或真菌培养后的提取液拌种播种，均可促进白及萌发和生长[13]；而白及非共生萌发是利用组培技术，在短时间内获得大量种苗[3,5-6,13]。

本实验发现，在基质播种和培养促白及种子萌发过程中未观察到菌根菌丝，实现了白及种子非共生萌发；然而基质直播状态下的成苗率及苗生长速度不及试管培养的。结合文献分析，一方面说明白及微小种子中贮备营养对种子萌发及幼苗分化影响较大；另一方面表明地生自养型白及，其种子具有非共生萌发的特性。

4 结 语

本实验观察发现，直播或培养条件下，白及种子萌发后，以“原球茎—幼苗”方式形成幼苗；原球茎或球形或棒状，而未发现有形态学特征的根状茎过渡阶段和共生萌发的菌根真菌菌丝体。此外，在原球茎分化成幼苗过程中，原球茎顶端及中央位细胞群对幼苗建成的贡献度较大，而其表层细胞出现萎缩或较长时间残存于茎基，此现象未见报道。笔者根据概念和观察结果，将白及种子萌发、幼苗的生长发育过程总结为5阶段：种子原胚—原球茎—幼苗—假鳞茎苗—小块茎丛生苗。此结果可为白及种苗繁育提供参考依据。