以脑内神经递质失衡为特征的抑郁症大鼠模型的改良研究

王东辉 潘彦舒 郭洋洋 郭 婕 程晓娜 韩振蕴

(北京中医药大学，北京，100029)

在前期的临床观察中，本团队发现抑郁症患者脑内的单胺类神经递质存在含量失衡的情况，表现为5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)↑、多巴胺(Dopamine,DA)↓，乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)↑、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)↓[1]。据此临床现象，本团队建立了以脑内神质失衡为特征的抑郁症大鼠模型[2]。原造模方法需要安装套管用以向左侧海马给药。套管安装后，注射多巴胺D1受体抑制剂SCH23390，以打破双侧海马和大脑皮质内神经递质含量的平衡，药物的剂量为2 μg/μL×1 μL/d，每注射2 d，休息1 d，反复3次，共计给药6次。然而，安装给药用套管会增加造模时间，且不利于强迫游泳实验和水迷宫等实验的开展。所以，本实验希望去除套管的安装，提高给药剂量，减少给药次数，以优化造模过程，并观察改良模型的有效性和病理特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠26只，体重250～270 g，购买自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0004]。饲养条件为：温度(22±1)℃；湿度(47±2)%；12 h昼夜交替光照，自由进食进水。

1.1.2 试剂及仪器 SCH23390(Sigma，批号：125M4614V)，5-HT(上海阿拉丁，批号：S111161)，DA(上海阿拉丁，批号：D103111)，NE(上海阿拉丁，批号：D134211)，5-HIAA(上海阿拉丁，批号：H133485)。

68003型脑立体定位仪(瑞沃德生命科技有限公司，深圳)，78001型颅骨钻(瑞沃德生命科技有限公司，深圳)，API3200型液质联用仪(Applied Biosystems)，UltiMate3000型高效液相色谱仪(Dionex)，MULTISKANMK3型全自动多功能酶标仪(Thermo)

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 大鼠采用单笼饲养 适应性饲养1周后，根据糖水消耗实验情况，将健康大鼠随机分组：正常对照组9只、原模型组11只、改良模型组11只。

1.2.1.2 模型的制备 第1次给药时用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,ip，后3次给药以乙醚吸入麻醉。将麻醉好的大鼠放置于带有微量注射器的脑立体定位仪上，依据Paxinos和Watson大鼠脑图谱所示[3]，定位大鼠左半侧海马(AP-3 mm,L 1.8 mm,H 3 mm)。使用颅骨钻在颅骨相应位置打孔，缓慢将微量注射器插入所需深度，注射SCH23390，剂量为8 μg/μL×1 μL/d，隔1 d给药1次，共给药4次。

1.2.1.3 原模型制备 1)安装给药用套管：原模型组以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,腹膜内给药，将麻醉好的大鼠放置于脑立体定位仪上，依据Paxinos和Watson大鼠脑图谱，定位左侧海马(AP-3 mm,L 1.8 mm,H 3 mm),使用颅骨钻在颅骨相应位置打孔，植入一微量注射用套管(直径0.56 mm，长度3.2 mm)和2枚配套螺丝，用牙托水、牙托粉固定。术后大鼠自由饮水饮食，连续3 d青霉素2×104单位,腹膜内给药，恢复1周后给药；2)给药：大鼠吸入乙醚麻醉，使用微量注射器，通过套管向海马注射SCH23390，剂量为2 μg/μL×1 μL，每给药2 d，休息1 d，共给药6 d。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 体重及行为学测试 正常对照组不做处理，给药后两周进行体重及行为学测试。1)体重测定：于成模后第14天进行体重测定；2)糖水消耗实验：依据文献[4]并加以调整，于成模后第14天进行糖水消耗实验，配制1%的蔗糖水，每只大鼠第1天给予2瓶蔗糖水，第2天给予1瓶蔗糖水和1瓶大鼠饮用水，第3天禁食禁水24 h，24 h后将1瓶重200 g的1%蔗糖水和1瓶重200 g的饮用水给予每只大鼠。于12 h后取走2种液体，并称量每瓶液体所剩质量，依据公式糖水偏爱率(%)=糖水消耗/总液体消耗×100%，求得每只大鼠的糖水偏爱率。3)旷场实验[5]：依据文献并加以调整，于成模后第14天进行，自制1个100 cm×100 cm×40 cm木箱，黑色，有底无盖，用白线将底部均匀划成5×5个方格。在安静、光线昏暗的环境下，将大鼠从同一位置、同一方向放置于木箱的中央，大鼠自由活动。计算5 min内大鼠活动的水平运动得分(大鼠四肢均穿过的方格数，若沿线行走，则以20 cm为1格)和垂直运动得分(两前肢完全抬离地面至少1 cm或攀爬箱壁至放下的次数)。在2只大鼠测试间歇，使用低浓度乙醇溶液擦拭敞箱，以防止上一只大鼠所留气味对其后大鼠的实验结果产生影响。

1.2.2.2 病理学检测 1)取材：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，断头后，取出脑组织，分离大脑皮质及左、右海马，装入离心管中，放于-20 ℃冰箱中备用。2)HLPC-MS测量皮层、左右海马中5-HT、DA、NE、5-HIAA含量：取组织，滴下生理盐水，匀浆。取匀浆液50 μL，加入含有内标异丙肾上腺素的甲醇200 μL，斡旋1 min后，13 000 r/min离心4 min，保证温度在4 ℃作用。取上清液，备用。色谱条件：流动相：A水相：水(0.1%甲酸)，B有机相：乙腈(0.1%甲酸)，色谱柱：MSLab C18(150×4.6 mm 5 μm)，柱温：50 ℃。进样量为10 μL，流速为1 mL/min。质谱条件：离子源，采用+ESI电喷雾离子源；喷雾电压为4 800 V；雾化气为50 psi；辅助气为60 psi；碰撞气为Medium；雾化温度为500 ℃；气帘气为20 psi；碰撞室射入电压:10，射出电压:2.0，扫描方式为MRM多反应监测。MRM(NE)=170.1/152.1，MRM(DA)154.1/137.1，MRM(5-HIAA)192.06/146.06，MRM(5-HT)=177.1/160.1，MRM(Is)=271.03/156.01。

1.2.2.3 ELISA法检测大脑皮质及双侧海马中AchE的含量，依据ELISA试剂盒手册测定。

2 结果

2.1 体重及行为学测定结果 造模2周后，同正常对照组比较，改良模型组糖水偏爱率显著降低(P<0.05)，体重、旷场运动水平和垂直运动均极显著降低(P<0.01)。与原模型组比较，改良模型组糖水偏爱率、体重变化率、旷场试验水平和垂直运动得分差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 左侧海马神经递质及AchE含量 造模两周后，同正常对照组比较，改良模型组大鼠左侧海马5-HT、NE含量极显著升高(P<0.01)；5-HIAA含量极显著减少(P<0.01)；DA含量呈降低趋势，AchE含量呈升高趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 右侧海马神经递质及AchE含量 造模两周后，同正常对照组比较，改良模型组大鼠右侧海马5-HT、NE含量极显著升高(P<0.01)；5-HIAA含量极显著减少(P<0.01)；DA含量呈减少趋势，AchE含量呈增加趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 大脑皮质内神经递质及AchE含量 造模两周后，同正常对照组比较，改良模型组大鼠大脑皮质中5-HT、NE、AchE含量呈升高趋势；5-HIAA、DA含量呈降低趋势(P>0.05)。见表4。

表1 各组大鼠体重及行为学变化

注：与正常对照组比较,**P<0.01;与正常对照组比较,*P<0.05

表2 左侧海马内神经递质及AchE含量变化

注：与正常对照组比较,**P<0.01

表3 右侧海马内神经递质及AchE含量变化

注：与正常对照组比较,**P<0.01

表4 大脑皮质内神经递质及AchE含量变化

3 讨论

抑郁症的动物模型有许多，主要可以分为手术模型、药物介导模型、应激模型和遗传模型等[6]。这些模型已经被广泛应用于抑郁症的研究中，但每种模型都存在一定的缺陷，如：慢性轻度不可预见性应激(CUMS)模型造模时需要保障造模环境的一致性，且造模耗时长，增加了工作量；嗅球摧毁模型是创伤性模型，大鼠死亡率较其他模型较高，增加了实验成本；遗传模型不能完全模拟抑郁症的发病过程，且应用不广泛。因此，开发新的抑郁症模型对抑郁症的研究意义重大。

在之前的研究中，本团队根据在体检测临床抑郁症患者脑内神经递质的变化规律建立了一种新的抑郁模型，该模型以脑内神经递质失衡为主要特征，在行为学表现上也符合抑郁症的特征。但是在造模过程中需要安装套管，这延长了造模时间，且不利于水迷宫、强迫游泳实验的进行。所以，本实验取消了套管的安装，提高给药剂量、减少给药次数，以缩短造模用时。

改良的造模方法为向左侧海马注射SCH23390，剂量为8 μg/μL×1 μL/d，给药频率为隔1 d给药1次，共4次。改良模型造成的抑郁状态依据行为学评价[7-8]。“快感缺失”是抑郁症的核心症状[9]，是指抑郁症患者体验快乐能力的下降。糖水消耗实验即是评估抑郁症动物模型的“快感缺失”情况[10]。抑郁症患者自主活动减少，旷场实验通过观察动物在陌生环境下穿越格子数、抬爪次数评价动物模型自主活动和探索行为的改变。常用的抑郁模型，如CUMS模型、习得性无助模型，糖水偏爱率、旷场实验得分均下降[11-12]。本实验中，改良模型的体重、糖水偏爱率、旷场实验水平及垂直运动得分均降低，表明改良的造模方法可以造成大鼠的抑郁状态。而同原模型比较，改良模型上述指标未有明显改变，表明改良模型、原模型所造成的抑郁程度相同。

经典的单胺递质假说认为抑郁症的发病与5-HT、NE、DA含量的改变有关[13]。本实验结果显示左、右侧海马5-HT、NE含量极显著增加、5-HIAA含量极显著减少，DA含量呈降低趋势；大脑皮质内5-HT、NE含量呈增加趋势，5-HIAA和DA含量呈降低趋势，这与王援朝[14]的观察结果相一致或呈现相应趋势，也与原抑郁症模型的神经递质改变相同。

AchE是Ach的水解酶，由于Ach性质不稳定，所以经常通过观察AchE含量的改变反应Ach含量的变化。抑郁大鼠脑组织中AchE增加[15]，而本实验中AchE含量呈升高趋势，这与其他实验结果相符合。

综上所述，改良的造模方法能够造成大鼠抑郁状态，所造成的抑郁状态与原模型相同，但因其减少了造模时间、所造模型可以用于强迫游泳实验、或水迷宫实验，实现了对原模型改良的目的。