加味四君子对宫颈癌大鼠模型癌组织中Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达的干预作用

王 剑 张 轶 刘月芬 毛宝宏 王文第 刘 青

(1 甘肃省妇幼保健院妇幼保健科研中心,兰州,730050; 2 兰州生物制品研究所有限责任公司,兰州,730046)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,仅有少数患者早期出现阴道分泌物异常、阴道接触性出血等症状,大部分患者并未出现任何临床症状,直至晚期因癌组织浸润其他组织器官出现继发性症状时疾病才被发现,具有极强的隐匿性[1]。因此探寻特异性指标做到尽早发现疾病是目前临床研究的重点。中医药的抗癌效果逐渐得到认可,四君子汤有益气健脾之功,首载自《太平惠民和剂局方》,临床不乏四君子汤加减有效抗肿瘤的报道[2-4],但其作用机制目前尚无统一定论,一定程度限制了其临床的推广应用。基于此,我们亦宫颈癌模型大鼠为研究对象,进行加味四君子汤干预,临床应用提供数据参考,具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar雌性大鼠30只均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(合格证:S20089382),平均值中(155±15)g,鼠龄均为6周。饲养于兰州生物制品研究所SPF动物房中心,饲养环境设置:温度22～24 ℃，平均温度(22±1.28)℃,湿度53%～55%,平均湿度(54±0.27)%。所有Wistar进行为期3 d的适应性喂养,随后将30只大鼠随机分为空白组10只,造模组20只,其中造模组大鼠接受宫颈癌模型制备,造模后随机分为模型组和干预组。3组大鼠在鼠龄、体重方面比较，差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.1.2 药物 加味四君子汤详方如下:人参12 g、白术9 g、茯苓9 g、半枝莲9 g、金银花9 g、香附6 g、黄柏6 g、凤尾草6 g、甘草3 g,所有中药均购自四川拓荒牛中药材种植有限公司,水煎备用。

1.1.3 试剂与仪器 人宫颈癌Hela细胞株(购自中国医学科学院基础研究所),10%水合氯醛(购自青岛宇龙海藻有限公司,国药准字H37022673),4%多聚甲醛(购自武汉百浩天生物科技有限公司),-actin、Caspase-3、Caspase-7、Survivin一抗抗体(均购自美国CST公司),BCA蛋白定量试剂盒(购自碧云天生物有限公司),DAB试剂盒(购自Solarbio公司),RPMI-1640培养液(购自江莱生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将人宫颈癌Hela细胞株置于RPMI-1640培养液进行培育,将培养瓶置于37 ℃体积分数为5%的CO2饱和湿度环境中,当细胞生长至对数期时加入适量的0.25%的胰酶进行消化,充分消化后用小牛血清培养基终止消化,将细胞液置于4 ℃离心机中1 500 r/min离心10 min,充分洗涤后将细胞计数调整为107个/mL。将大鼠置于无菌手术操作台,在大鼠腋窝皮下组织注射0.5 mL人宫颈癌Hela细胞悬液,常规饲养7 d后大鼠出现明显的肿瘤结节提示造模成功,反之则提示造模失败[5]。本研究对20只大鼠进行模型制备,其中2只大鼠未出现肿瘤结节,提示造模失败,将18只造模成功大鼠随机分为模型组及干预组，每组9只。

1.2.2 干预方法 干预组大鼠每天接受加味四君子汤灌胃,以150 mg/kg·d剂量进行干预,所有大鼠均只有饮食且术后饲养环境相同。1剂/d,空白组及模型组大鼠仅每天接受模拟抓取,并用等体积的生理盐水灌胃。各组大鼠均连续干预8周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 宫颈癌病灶大小 对模型组及干预组大鼠的宫颈癌病灶大小进行测量,记录长、宽、高的数据,并计算出体积。

1.2.3.2 Western blotting法检测Caspase-3、Caspase-7浓度变化 干预结束后各取模型组及干预组各3只大鼠的肿瘤组织50 mg,空白组3只大鼠腋窝皮下组织50 mg。分别加入蛋白裂解液将组织的充分裂解匀浆,用BCA试剂盒对各样本的蛋白浓度进行测定,随后将样本在水浴中进行蛋白变性,取出适量样本进行SDS-PAGE电泳跑胶,随后进行转膜、内参及Caspase-3、Caspase-7抗体孵育,随后将目标PVDF膜充分洗涤后进行二抗孵育,加入ECL显影液后进行图片显影,读取OD值,并用Image(BIO-RAD公司)的图像处理软件进行数据处理。

1.2.3.3 免疫组化法检测Survivin水平变化 干预结束后随机抓取各组3只大鼠腹腔注入10%水合氯醛充分麻醉后腹主动脉灌注4%多聚甲醛进行组织固定,模型组及干预组取出肿瘤组织,空白组取腋窝皮下组织,进行组织脱水、包埋、切片、固定,随后将切好的组织片进行脱蜡,在进行抗原修复、加入内源性过氧化物酶阻断剂,随后用PBS冲洗,避光环境下加入DBA溶液进行显色,调整显色时间后用自来水将DAB冲洗干净,封片,显微镜下读片,每张载玻片片随机选择5个视野进行观察并计算。

2 结果

2.1 宫颈癌病灶大小的变化 空白组未出现宫颈癌病灶,模型组病灶体积(1 573.48±11.24) mm3,干预组病灶体积(683.23±4.81) mm3,各组宫颈癌病灶大小差异有统计学意义(P<0.05),干预组明显较模型组小。见表1。

表1 各组宫颈癌病灶大小

图1 各组Caspase-3、Caspase-7 Western blot电泳结果

组别Caspase-3/内参IOD比值Caspase-7/内参IOD比值空白组4.723±1.0213.634±0.035模型组1.162±0.1370.479±0.223干预组2.571±1.1261.984±0.121Z8.2874.323P0.0030.002

图2 各组Survivin浓度的变化

组别Survivin光密度空白组34.382±1.281模型组502.132±0.932干预组212.531±1.281Z7.243P0.025

2.2 各组大鼠Caspase-3、Caspase-7、Survivin浓度变化 2组接受造模术大鼠Caspase-3、Caspase-7浓度均有不同程度下调,Survivin表达升高,其中干预组大鼠经过为期8周的干预后Caspase-3、Caspase-7浓度上调,Survivin浓度下降,干预组改善明显优于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2及表2、表3。

3 讨论

宫颈癌是目前临床常见的妇科恶性肿瘤,手术在早期介入有较理想的临床疗效,但该病发生发展隐匿,多数患者发现疾病时依然处于中晚期,丧失了手术最佳时间窗,由此新辅助化疗成为中晚期宫颈癌的主要治疗手段[6],然而通过长期的临床观察我们发现,虽然化疗药物可直接作用于瘤体抑制其生长,但与此同时带来的不良反应亦给患者造成了严重的影响,阻碍了治疗依从性。中医药以其疗效显著,安全性高等诸多优势被逐渐运用于抗癌临床治疗中,中医认为宫颈癌属于“崩漏”“带下”“癥瘕”等范畴,《黄帝内经》云:“正气存内、邪不可干”“盖冲任失调,督脉失司,带脉不固,因而带下”。宋代医学家陈自明在其代表作《妇人大全良方》写道:“产后血气伤于脏腑,脏腑虚弱为风冷所乘,搏于脏腑,与气血相结,故成积聚瘢块也”。由此不难看出气血亏虚是宫颈癌发生发展的主要病因,妇人机体正气亏虚,脏腑功能失调,外邪趁虚而入,或因寒湿,或因痰瘀,侵袭胞宫,脉络阻滞,郁久化热,热瘀毒郁结于宫颈而成此病,故健脾益气,清热解毒,化瘀散结是治疗本病的关键[7]。本研究在四君子汤基础上加用清热解毒散瘀之品,方中人参益气健脾养胃,气血生这正气充盈;白术健脾燥湿,加强人参的益气之功;茯苓甘淡渗湿,白术、茯苓合用促使健脾祛湿之功倍增;方中半枝莲、金银花以清热解毒,香附首载于陶弘景的《名医别录》,有理气之功,是气病之总司,女科之主帅。黄柏有清热解毒的功效,如膀胱、大肠经,可清除下焦湿热,《神农本草经》描述到:“主五脏肠胃中结热,女子漏下赤白,阴伤性疾”。凤尾草味淡微苦,主入大肠经及心经,《分类草药性》曰:“凤尾草,可主一切热毒之疾,可消肿清火也”,是专治妇人疾病之良品。甘草可调和诸药药性,又可健脾胃以固中气之虚羸,调和阴阳以平衡营卫之势。整方共奏益气健脾,扶正固本,清热解毒散瘀之功。

在对加味四君子汤作用机制的进一步研究中我们发现其可影响Caspase-3、Caspase-7、Survivin的浓度变化,可上调宫颈癌模型大鼠Caspase-3、Caspase-7的浓度,抑制Survivin的表达。宫颈癌病情的进展与肿瘤细胞的过度增殖及凋亡减弱有关[6-10],诱导肿瘤细胞的凋亡是抗癌的主要方向,肿瘤细胞的凋亡减弱,导致机体原本细胞增殖/凋亡平衡受破坏,导致大量的肿瘤细胞无法正常凋亡而出现异常增殖,病情日久则肿瘤病灶日趋增大,并逐渐向其他组织或器官侵润扩散,因此抑制肿瘤细胞的过度增殖,促进其凋亡是抗癌的靶向[11-14]。Caspase家族是介导肿瘤生长周期的重要因子,其中Caspase-3、Caspase-7是其关键成员,其浓度升高可促进肿瘤细胞的凋亡。Survivin[15-17]是目前公认的抑制细胞凋亡的因子,Survivin可通过激活因子酶原的活性而产生抑癌效应,有研究发现健康肌体Survivin几乎无表达,而宫颈癌肿瘤组织中的Survivin呈现高表达状态[18],因此有研究人员[19-20]认为Survivin可作为诊断及评估恶性肿瘤治疗疗效的独立因子。在本研究中我们认为加用加味四君子汤的大鼠Caspase-3、Caspase-7表达上调,Survivin水平减弱,由此我们认为加味四君子汤可通过诱导促凋亡抑制的表达,从而实现抑制肿瘤细胞的凋亡,重新维护增殖与凋亡间的平衡,抑制肿块的生长,缩小肿瘤组织体积。

由此,我们认为加味四君子汤有明显的抗癌功效,可显著缩小宫颈癌病灶体积,其作用机制可能是通过调节Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达而实现促进肿瘤细胞凋亡有关,临床建议推广运用。