桑叶对2型糖尿病大鼠肝脏Toll样受体及其下游信号元件基因表达的影响

王 敏 马全涛 李亚琪 柳辰玥 张 驰 邱敏懿 张彩娟 王 停 赵保胜 李红燕

(1 北京中医药大学中药学院，北京，102488； 2 北京中医药大学/北京中医药研究院，北京，10029； 3 北京中医药大学第三附属医院，北京，100029)

糖尿病是由于遗传或环境等多种因素引起机体胰岛素分泌量相对或绝对减少，导致糖类、脂类及蛋白质类等物质代谢紊乱而产生的慢性疾病。城市化，老龄化以及人民生活节奏的加快使糖尿病发病率呈上升趋势。最新报告显示，中国成年人中约有1.14亿糖尿病患者，发病率高达10.4%，其中约90%为2型糖尿病(T2DM)，糖尿病已成为严重威胁我国人民生命健康的非传染性疾病之一[1]。

T2DM的发病机制暂无定论，其主要病理特征之一为胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)。IR即胰岛素调控葡萄糖代谢的生物学效应降低，机体代偿性分泌胰岛素以维持血糖稳定，贯穿于T2DM的全过程[2]。肝脏是胰岛素作用的主要器官，也是发生IR的重要场所[3]。IR的发生与诸多因素有关，炎性反应是其中之一[4]。炎性反应是人体的重要防御机制，机体遭受侵袭后，激活免疫细胞，产生并释放肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)，白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)以及C反应蛋白(C-reactive Protein,CRP)等炎性反应递质进行自我保护。Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)是免疫应答中重要的模式识别受体，其与配体结合后，可通过髓样分化因子(Myeloid Differentiation Factor 88,MyD88)依赖性信号途径或MyD88非依赖性信号途径转导，激活核因子-B，诱导分泌炎性反应递质[5]，干扰胰岛素信号的传递，导致或加重IR[6]。

桑叶为桑科植物桑(MorusalbaL.)的叶，味苦、甘，性寒，归肺、肝经，有疏风散热、清肺润燥、清肝明目之效，为临床常用中药，其用于糖尿病的治疗最早载于《本草纲目》，言曰:“桑叶……明目长发，止消渴”。中医“消渴证”与现代医学糖尿病特征相似[7]。临床研究表明，桑叶及其配方治疗T2DM药效显著[8-9]，对T2DM并发症亦有一定的防治作用[10-11]。桑叶体内含有生物碱、黄酮以及多糖[12-13]，可通过抑制葡萄糖吸收[14]，抑制B细胞凋亡[15]，改善PI3K信号转导等途径实现降糖作用[16]。同时有报道桑叶可以通过抑制炎性反应递质的表达而降低血糖[17]，但是桑叶抗炎降糖的作用机制研究鲜有报道。本课题组前期研究发现，桑叶可降低自发性糖尿病模型KKAy小鼠胰腺组织中TLR2和TLR4 mRNA的表达[18]，后续实验中又发现桑叶可降低T2DM小鼠肝脏组织中TLR7、TLR8、TLR9的表达[19]。因此，本实验拟在前期实验的基础上，进一步探究桑叶对TLRs受体及其下游信号元件表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取雄性Wistar大鼠，SPF级，体重180～200 g，斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0002，饲养于北京中医药大学屏障环境动物房，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2016-0038。

1.1.2 药物 桑叶(经北京中医药大学中药学院中药鉴定系刘春生教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶)，由北京仟草中药饮片有限公司提供；二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，批号：AAT8173)。

1.1.3 试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma，批号：WXBB6772V)；稳豪ONE TOUCH血糖试纸[强生(上海)医疗器材有限公司，批号：4002886]；无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20110104)；生物合成人胰岛素注射液[诺和诺德(中国)制药有限公司，批号：EVG4950]；大鼠ELISA胰岛素试剂盒(美国ALPCO，批号：04857)；大鼠ELISA TNF-试剂盒(美国Life Technologies，批号：1818268A)；大鼠ELISA IL-6试剂盒(美国Life Technologies，批号：1780090B)；大鼠ELISA CRP试剂盒(美国Life Technologies，批号：0739103116)；Trizol试剂(美国Invitrogen，批号：15596)；cDNA合成试剂盒(美国Thermo Scientific，批号：00279105)；SYBR Green试剂盒(Applied Biosystems，批号：1508501)；Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Scientific)；CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；Biofuge Primo型离心机(美国Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 大鼠适应性饲养1周后，随机选取10只为正常组，维持饲料喂养，其余大鼠高脂饲料喂养8周后，禁食14 h，腹腔注射1%STZ柠檬酸钠缓冲液(0.1 mmol/L，pH 4.2～4.5，4 ℃)，剂量为20 mg/kg体重，正常对照组仅腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。注射后第7天剪尾采血，测定大鼠空腹血糖，血糖值大于12 mmol/L即视为造模成功。大鼠按空腹血糖值随机分为模型组、二甲双胍(0.2 g/kg)组、桑叶高剂量(3 g/kg)组和桑叶低剂量(1 g/kg)组，每组12只。

1.2.2 给药方法 称取桑叶5 kg，加10倍质量的去离子水，85 ℃煎煮10 h，加热回流90 min，过滤，浓缩至相当于生药量3.75 mg/mL。灌胃给药,1次/d，连续12周，正常组和模型组给予等量动物饮用水。

1.2.3 检测指标与方法 1)一般指标检测：每周测定大鼠体重及24 h内进食量和饮水量各1次，给药11周各组禁食不禁水12 h后进行空腹葡萄糖耐量实验(OGTT)，灌胃给药,1 g/kg葡萄糖溶液，测定0、15、30、60、90、120 min内各组血糖值。给药第12周禁食不禁水12 h后进行胰岛素耐量实验(ITT)，灌胃给药，75 U/kg胰岛素，测定0、15、30、60、90、120 min各组血糖值。上述实验结束后，禁食14 h后，腹主动脉取血，低温离心取血清，根据试剂盒说明书要求测定血清中胰岛素、TNF-、IL-6、CRP水平。2)TLR7、TLR8、TLR9、MyD88、TRAF-6、NF-B mRNA的水平测定：大鼠麻醉后取肝脏最大叶，-80 ℃保存。Trizol法提取肝脏组织总RNA，核酸蛋白紫外分光仪检测RNA浓度及完整性。NCBI数据库查询大鼠RNA总序列并设计引物，引物由北京博迈德基因技术有限公司合成。各引物序列如下：

β-actin上游5-CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG-3，下游5-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3，TLR7上游5-GTGTGCACCAAGAGGCTACA-3，下游5-TGGCCCAGGTAGAGTAGATTC-3，TLR8上游5-CTGTGGAATGCAAATGATGG-3，下游5-TCATTTCTCCCCAAGTCCAG-3，TLR9上游5-TGCAGGAGCTGAACATGAAC-3，下游5-ATTGGACAGGTCCACAAAG C-3，MyD88上游5-GTGGTGGTTGTTCTGACGAT-3，下游5-CGCAGATAGTGATGAACCGTAG-3，TRAF-6上游5-CATTGTGAATTCGCTCTAGTGA-3，下游5-GGACAGCTTTGATCGTGGA-3，核因子-B上游5-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3,下游5-TCCGGAACACAATGGCCAC-3。按照SYBR Green试剂盒要求，使用PCR扩增仪，于20 μL反应体系进行扩增。每个样本设定2个平行孔，取其均数计算CT值，按照如下Pfaffl公式计算目的基因表达量[20]。

Ratio=(Etarget)△CT,target(calibrator-test)/(Eref)△CT ref(calibrator-test)

△CTtarget(calibrator-test)=(CTtarget)A549-(CTtarget)A549PTX

△CTref(calibrator-test)=(CTref)A549-(CTref)A549PTX

其中Etarget、Eref分别为目的基因和内参基因的扩增效率。

2 结果

2.1 5组T2DM大鼠体重及饮水进食比较 实验中，部分大鼠在实验后期出现了低血糖死亡，所以最终统计的动物数量出现了差异。由于桑叶起效较慢，前期大鼠各项指标变化不明显，因此仅列出第12周的数据。与正常对照组比较，模型组体重明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，血糖值、饮水量和进食量均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组血糖和进食、饮水量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但体重变化不明显；桑叶组血糖和饮水量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但体重和进食量变化不明显。见表1。

2.2 5组T2DM大鼠糖耐量和胰岛素耐量比较 第11周，与正常对照组比较，模型组出现明显的糖耐量异常，差异有统计学意义(P<0.05)，曲线下面积高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组糖耐量改善明显，曲线下面积缩小明显，差异有统计学意义(P<0.05)，桑叶高剂量组90 min和120 min时血糖值明显降低，曲线下面积出现明显差异，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 5组T2DM大鼠血清胰岛素含量及胰岛素耐量比较 注射胰岛素后，与正常组对照比较，模型组为明显的胰岛素耐量异常，差异有统计学意义(P<0.05)，AUC明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)，其空腹胰岛素含量明显升高，胰岛素抵抗指数显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和桑叶高剂量组AUC显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，血清胰岛素含量明显下降，胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、4。

表1 5组T2DM大鼠体重及饮水进食比较

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,*P<0.05

表2 5组T2DM大鼠糖耐量和胰岛素耐量比较

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,△P<0.05

表3 5组T2DM大鼠ITT比较(第11周)

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,△P<0.05

表4 5组T2DM大鼠胰岛素水平比较

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,△P<0.05

2.4 5组T2DM大鼠血清炎性反应递质比较 与正常对照组比较，模型组血清中IL-6、TNF-和CRP水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)：与模型组比较，二甲双胍可以明显降低IL-6、TNF-和CRP水平，差异有统计学意义(P<0.05)；桑叶组IL-6和CRP水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，TNF-有一定的降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 5组T2DM大鼠血清炎性反应递质比较

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,△P<0.05

2.5 5组T2DM大鼠肝脏TLRs及其下游信号元件mRNA比较 与正常对照组比较，模型组TLR7、TLR8、TLR9及TRAF-6、MyD88、核因子-B表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍、桑叶高剂量可以明显降低TLRs受体及其下游信号蛋白的基因表达量，桑叶低剂量可以明显降低TLRs受体及其下游信号蛋白的基因表达量，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

3 讨论

T2DM是以高胰岛素血症和胰岛素抵抗为特征的非传染性疾病。患者多有饮食不节，过食肥腻，好逸恶劳之恶习，中医学将之列入“消渴”的范畴，中医认为“消渴症”的病机为阴虚燥热或兼有痰湿血瘀证，治疗以益气养阴清热药为主，或配伍以化痰祛瘀药。桑叶味甘性寒，甘以养阴，寒以凉血，兼有清、润之效，临床常用于治疗阴虚内热型消渴[21]。本实验通过观察桑叶对高脂饲料喂养联合STZ注射制备T2DM大鼠的治疗作用，发现桑叶可以有效降低大鼠空腹血糖值、饮水量，改善T2DM大鼠OGTT和ITT，同时发现桑叶可以降低HOMA-IR，说明桑叶可以改善T2DM大鼠胰岛素抵抗。

桑叶可以降低T2DM大鼠血清中IL-6、TNF-、CRP的水平，提示桑叶改善胰岛素抵抗，治疗T2DM，可能是通过降低炎性反应水平来实现的。研究显示，相较于未患病者，T2DM患者体内IL-6、TNF-和CRP水平明显升高，说明T2DM患者体内存在炎性反应[22]。有学者认为，T2DM是机体非特异免疫产生的慢性炎性反应[23]。炎性反应是机体应对外界刺激产生的防御机制，机体受到病毒、抗原等刺激时，免疫细胞被激活，可分泌IL-6、TNF-和CRP来进行自我保护。IL-6主要由脂肪组织分泌，肝脏也是其分泌的重要部位，正常生理状态下，IL-6有利于肝糖代谢，T2DM患者体内脂肪代谢紊乱，身体长期处于慢性炎性反应浸润状态下，长期过量分泌的IL-6可导致胰岛B细胞功能损伤，产生IR[24]。TNF-具有多种生物学活性，可以诱导IL-6等多种炎性反应递质的分泌，在T2DM过程中，可直接作用于胰岛B细胞，抑制胰岛素分泌或者通过抑制胰岛素受体信号和葡萄糖转运导致或者加重IR[25]。CRP为非特异性免疫的炎性标志物，是预测T2DM发病的危险因子，其在TNF-和IL-6等炎性反应递质的刺激下由肝脏产生分泌，可以通过抑制胰岛素受体酪氨酸激酶加重IR[26]。本实验中在前期实验研究基础上发现桑叶不仅可以降低糖尿病大鼠肝脏组织TLRs的表达，同时还可以下调其下游信号元件TRAF-6、MyD88以及核因子-B的相对表达。

表6 5组T2DM大鼠肝脏TLRs及其下游信号元件mRNA相对表达量

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,△P<0.05

TLRs介导的信号通路在炎性反应中具有重要作用，目前在哺乳动物体内共发现13个具有功能的TLRs，其中TLR1～TLR9为人鼠共有。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，主要分为胞外域、跨膜区和胞内域3部分，胞外域因与白细胞介素-1受体序列高度相似，被称作Toll/IL-1(TIR)结构域，主要负责介导下游信号转导[27]。TLRs介导的信号途径主要为两类：一类是MyD88依赖性通路：MyD88活化后与IRAKs结合，活化后的IRAKs与TRAF6磷酸化，并与MyD88解离。TRAF6在与Ubc13/Uevl A催化下发生泛素化，泛素化后的TRAF6激活TAK1，引起IKK复合物磷酸化，促使I-B磷酸化，并与核因子-B解离，核因子-B进入细胞核，激活炎性反应基因，诱使其表达。TLR5、TLR 7、TLR 8、TLR9与配体识别后可以直接激活MyD88，TLR2和TLR在与Mal蛋白结合后再识别MyD88[28]。另一类是非MyD88依赖性通路，由TLR3、TLR4、TLR5激活[29]，间接促进核因子-B的表达，刺激炎性反应递质分泌。本实验在前期研究基础上利用实时PCR技术对桑叶干预后糖尿病大鼠肝脏组织进行检测，其TLR7、TLR 8、TLR9以及其下游信号通路中MyD88、TRAF6、核因子-B mRNA表达，均出现了不同程度的下降，因此，桑叶可能是通过抑制TLRs及其下游信号元件表达，进而抑制炎性反应，发挥降糖作用。