肾复康对肾纤维化模型大鼠转化生长因子-β1、Smad2、Smad7表达的影响

刘劲松 林 哲 郑燕姣

(湖南省中医院研究院附属医院肾内科，长沙，410006)

肾间质纤维化是诸多肾脏疾病发生发展过程中的共同病理过程[1-3]，肾纤维化的发生提示肾功能恶化，因此深入研究肾纤维化的机制，探索有效的干预措施抑制肾纤维化过程是减少诸多肾脏疾病和延缓其病情发展的关键。肾纤维化属于中医学“水肿”“关格”“虚劳”等范畴，历代医家认为肾纤维化过程中素体正气逐渐虚损，邪毒日渐瘀滞，长期的正邪相争后形成邪盛正虚的病理变化[4-6]。近年来中草药以其毒性低、疗效显著等优势被众多科研工作者纳入研究。肾复康是我院经验方，由土黄芪、太子参、生地黄、山茱萸、茯苓、白花蛇舌草、蝉花、丹参、大黄等药物组成，有显著的健脾补肾、泻浊排毒的作用，本研究尝试通过HE染色实验、免疫组化实验、Western blotting检测，观察肾复康对肾纤维化模型大鼠的影响，旨在为中医防治肾纤维化提供新思路及实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取SPF级SD大鼠70只，雌雄各半，体重(200±20)g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号为№3567824。饲养条件：温度(23±1)°C，湿度(50±1)%，以12/12 h为光暗周期。

1.1.2 药物 肾复康(生黄芪30 g、太子参15 g、生地黄15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、白花蛇舌草30 g、忍冬藤30 g、蝉花15 g、丹参15 g、大黄8 g)，由湖南省中医药研究院中心药房提供。

1.1.3 试剂与仪器 24 UP测试盒(南京建成生物工程研究所产品，批号20170819)、SCr测试盒(南京建成生物工程研究所产品，批号20179812)、BUN测试盒(南京建成生物工程研究所产品，批号20170521)，TGF-β1一抗(美国CST生物公司,型号：BY-3283R)，Smad2(美国CST生物公司,型号：BY-3551R)、Smad7(美国CST生物公司,型号：BY-3526R)。4%多聚甲醛溶液(上海西塘生物试剂有限公司)，苏木精-伊红(HE)(上海西塘生物试剂有限公司)，盐酸溶液(上海西塘生物试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1)分组：于实验条件下适应环境3 d后，随机挑选10只作为假手术组，其余大鼠禁食12 h后进行造模，造模成功后随机分为肾复康组(低剂量组15只、中剂量组15只及高剂量组15只)及模型组(15只)[7]。各组在性别、体重、鼠龄等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2)模型制备：将大鼠进行禁食不禁水12 h后利用10%水合氯醛以0.3 mL/kg的剂量进行麻醉，造模过程根据大鼠的麻醉情况可适当补充水合氯醛，充分麻醉后将大鼠以右侧卧位的体位固定于手术台上，将左侧腹部皮毛剔除，露出手术部分，利用75%乙醇常规消毒后从背部距左侧肋脊角1.5 cm处做一长约2 cm的斜切口，用分离钳将皮肤肌肉逐层钝性分离，直至将左侧肾脏充分暴露，随后将左侧输尿管钝性分离暴露，并在近肾门处和输尿管上1/3处进行双重结扎，最后将左侧肾脏回纳原位后逐层缝合。

1.2.2 干预方法 1)给药剂量：根据成人与大鼠用药剂量换算法肾复康制作成水平4.58、9.16、18.32 g/(kg·d)进行灌胃。将大鼠腹腔注射10%水合氯醛，2～3 mL/kg腹腔麻醉。模型组行左侧输尿管结扎术，假手术组仅游离左侧输L尿管但不结扎，肾复康组、模型组在造模成功后，动物清醒1 h后灌胃给药。假手术组(4 mL蒸馏水灌胃)、模型组(4 mL蒸馏水灌胃)，肾复康组，各组造模后每日灌胃2次，时间分别为9：00和15：00，连续21 d，直到处死为止。

1.2.3 检测指标与方法 1)24 UP、SCr、BUN水平:处死前1 d收集各组笼内24 h尿液，根据相关的试剂盒说明书进行24 UP、SCr、BUN水平的检测。2)肾脏组织病理学观察：各组随机选取3只大鼠，将左肾取出后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并按说明书进行脱水、石蜡包埋，随后将蜡块进行修切后制成4 μm厚度的切片，并将切片进行苏木精-伊红染色，随后用显微镜观察各组左肾组织的染色结果。参参考文献[8]对结果进行评分，0分为肾脏组织未见病理性改变；1分为肾脏组织出现轻度肾小管扩张、萎缩或坏死，病变范围≤1/4；2分为肾脏组织出现中度肾小管扩张、萎缩或坏死，1/4<病变范围≤1/2；3分为肾脏组织出现中度肾小管扩张、萎缩或坏死，病变范围>1/2。每个切片随机选取5个视野，取平均值作为最终结果。3)用Western blotting检测Smad2 Smad7和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平：各组随机选取3只大鼠，剪取左肾组织约100 mg，加入裂解液充分裂解组织，将溶液高速离心(4 ℃,1 000 r/min)15 min，抽取上清液进行蛋白定量，并根据相应的蛋白水平计算上样量。将各组标本溶液于金属浴锅100 ℃条件下变性10 min，按照碧云天胶体配制说明书事先配制电泳胶体，加入样本后进行电泳，后进行转膜、染色、封闭蛋白，最后将反应膜置于化学发光成像仪上，加入ECL发光液显影，随后进行A值读取。4)免疫组化检测TGF-β1水平：各组随机选取3只大鼠，将左肾取出后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并按说明书进行脱水、石蜡包埋，随后将蜡块进行修切后制成4 μm厚度的切片，将切片经过新鲜二甲苯、梯度乙醇、自来水、磷酸盐缓冲液(PBS)分别冲洗后将切片置于抗原修复液中进行修复，随后加入内源性过氧化物酶阻断剂，充分反应后连续使用PBS浸洗，后加入非特异性染色阻断剂后加入1∶ 1 000配制的TGF-β1抗体，将反应物置于4 ℃冰箱内孵育24 h，随后再次用PBS浸洗，最后用自来水浸洗去除切片表面的PBS，用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)进行显色后用苏木精染色，随之自来水冲洗、返蓝、乙醇、二甲苯浸泡后用中性树脂封片，最后在光镜下读片。

表1 5组24 UP、SCr、BUN比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

2 结果

2.1 5组24 UP、SCr、BUN比较 与假手术组比较，肾复康组及模型对照组24 UP、SCr及BUN水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，肾复康组24 UP、SCr及BUN水平有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着肾复康剂量升高趋势更明显。见表1。

2.2 5组肾脏组织病理学比较 与假手术组比较，肾复康组及模型组肾组织病理评分均明显升高，其中肾复康组评分低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，随着肾复康剂量的增加病理评分逐渐下降。见表2。

2.3 5组TGF-β1、Smad2 Smad7比较 假手术组肾组织仅有少量TGF-β1、Smad2表达，模型组Smad2、TGF-β1呈高表达，随着肾复康水平的增加Smad2、TGF-β1水平逐渐下降。造模后Smad7水平下降，肾复康干预后Smad7水平有所上调，并随着水平的增加而上调趋势更明显。见表3～4及图1。

表2 5组肾脏组织病理学比较分)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

表3 5组TGF-β1阳性细胞数比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

表4 5组Smad2、Smad7/内参(IOD比值)比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

图1 5组Smad2、Smad7蛋白表达

3 讨论

古代医学书籍并无“肾纤维化”这一说法，结合该病的临床症状认为其属于“水肿”“关格”“虚劳”等范畴。此病与脾肾两脏关系密切，脾肾分清泌浊能力是否正常是关于本病是否发生的关键，而脾肾的分清泌浊能力有赖于气化而进行。机体中肺、脾、肝等功能的异常均可影响气化，肾气亏虚更是气化异常的根本，气化不足则机体分清泌浊障碍，则水液、毒物无法及时转输及运化，从而产生了湿浊、血瘀等病理产物[7-8]。有临床资料显示，肾纤维化是形成是一个漫长的、难治的过程，久病必虚，随着正气逐渐耗损，邪毒瘀积渐盛，正邪相争后致邪盛正虚，故肾纤维化形成的各个阶段均以正气虚损为主，瘀血形成为标[9-12]。基于此有研究人员对治疗肾纤维化的中药复方进行数据挖掘分析，结果显示补益药使用频率占首位，随之是活血化瘀药及清热药[13]。在单味药使用总结中发现黄芪是使用频率最高的中药，依次是大黄、当归、丹参、川芎、牛膝、山药。可见正因为存在“正虚”，故补益药占据比例最大，而本研究发现，活血化瘀药使用频率仅次于补益类药物，因此我们认为活血化瘀亦应是治疗肾纤维化的基本方法。本研究所使用肾复康由我院肾病专家肖德才教授根据肾脏病中医病因、病机，总结几十年临床经验所创立。方中黄芪、太子参有益气之功，生地黄、山茱萸以及茯苓可加强健脾功效，且有补肾作用；现代药理学研究显示黄芪可明显增强机体免疫能力，而山茱萸可明显改善肾小球滤过功能。白花蛇舌草、忍冬藤、蝉花、大黄、丹参具有清热泻浊、排毒化瘀的功效，现代药理学证实白花蛇舌草、大黄等提取物有明显消炎效应，并可显著降低肌酐改善肾功能。肾复康药物配伍共奏健脾益肾，泄浊排毒，充分体现辨证施治的特点[14]。前期研究已证实，肾复康可明显改善原发性膜性肾病患者的临床症状，减少尿蛋白，提高机体免疫[15]。本研究观察了5组肾组织病理学改变，其中假手术组并未出现明显异常，而造模组出现了不同程度肾小管扩张、萎缩或坏死，其中肾复康组随着水平的升高病情逐渐改善，并且大鼠的肾功能亦有了明显改善，这证实了肾复康确可在一定程度改善肾功能。

在对作用机制的研究中我们对各组的肾脏组织的TGF-β1/Smad信号通路进行检测，机体具有多种因子可导致肾纤维化，各种致纤维化因子之间亦存在复杂的关系，TGF-β是具有明显的促进肾纤维化生物学效应[16]，对于肾脏细胞的增殖、分泌、迁移及凋亡过程均有参与[17-19]。Smad是目前认为的细胞内唯一存在的TGF-β相应酶激活物，可介导TGF-β的细胞内信号传导，TGF-β1可将细胞膜表面相应的I型受体相结合，形成复杂的Smad2、Smad3及Smad7等因子，Smad2可诱使生物因子并核移位转入细胞内产生生物效应，Smad7是TGF-β蛋白在信号通路中的负调控因子，在肾小球及肾小管组织有丰富的表达，TGF-β1/Smad信号通路是着眼肾纤维化的关键[20-21]。研究中假手术组肾组织仅有少量TGF-β1、Smad2表达，模型组Smad2、TGF-β1高表达，随着肾复康水平的增加Smad2、TGF-β1水平逐渐下降。造模后Smad7水平下降，肾复康干预后Smad7水平有所上调，并随着水平的增加而上调得趋势更明显。这提示肾复康可通过抑制TGF-β对Smads的激活，从而抑制TGFβ/Smad信号通路的转导，减少肾纤维化程度，且其作用效应具有一定的剂量依赖性。