IL-38及其受体IL-36R mRNA在结直肠癌中的表达及意义

张 瑜，金建军，田笑笑

河南科技大学第一附属医院消化内科，河南 洛阳 471003

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国常见的消化系统恶性肿瘤，发生率和死亡率均高居第4位，仅次于肺癌、食管癌和胃癌[1]。大量证据证实，炎症与CRC发病密切相关。常见的CRC相关炎症因子包括：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-8、IL-33和IL-1等[2-5]。IL-38作为IL-1家族中的新成员，不仅与炎症有关，而且与肺癌的发生、发展及预后有关[6-7]。本研究采用实时荧光定量PCR检测IL-38 mRNA在CRC及癌旁正常组织中的表达，同时检测IL-38受体IL-36R mRNA的表达，并探讨两者的相关性及临床意义。

1 材料与方法

1.1标本收集收集河南科技大学第一附属医院普通外科CRC手术切除标本62例，男36例，女26例，年龄(55.9±12.7)岁(41～72岁)。高-中分化腺癌38例，低分化腺癌24例。临床Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期19例。有淋巴结转移32例，无淋巴结转移30例。所有诊断均经病理报告确诊。手术切除癌组织同时取其5 cm以外的癌旁正常组织，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

1.2主要仪器及试剂NanoDrop One超微量紫外分光光度计(赛默飞公司，美国)，ABI 7500荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。TRNzol试剂、反转录RT-PCR 试剂盒和SYBR Green 荧光定量PCR试剂盒均购自天根生化科技有限公司(北京，中国)。

1.3总RNA提取及cDNA合成取冻存组织100 mg，加入TRIzol试剂1 ml，按照试剂操作说明书提取总RNA，超微量紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。取500 ng总RNA，按照反转录试剂盒说明书操作进行反转录，得到cDNA于-20 ℃保存。

1.4荧光定量PCR采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR以检测目的基因IL-38和IL-36R mRNA 在62例CRC和对应癌旁正常组织中的表达。参照文献[8]设计引物：IL-38：5′-TTATCCTTGTGGGCTCAGTT-3′(上游)，5′-AATCCGTTCCCTTGGCTTTT-3′(下游)；IL-36R：5′-GCTGGAGTGTCCACAGCATA-3′(上游)，5′-GCGATAAGCCCTCCTATCAA-3′(下游)。利用管家基因GAPDH作为内参照标化IL-38和IL-36R基因的表达。GAPDH引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′(上游)，5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′(下游)。引物由上海生工生物技术公司合成。反应体系20 μl，含SYBR Green (2×) 10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，cDNA模板2.0 μl，无RNA酶水6 μl。反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。反应结束后，设置熔解曲线反应条件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用2-ΔCt进行相对定量，Ct值为荧光信号达到设定阈值所经历的循环数，ΔCt=Ct(目的基因)- Ct(管家基因)。

1.5统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，由于实时荧光定量PCR结果呈非正态分布，数据以中位数表示，IL-38和IL-36R mRNA相对含量组间比较采用Mann-WhitneyU检验，IL-38和IL-36R mRNA表达量之间的关系采用Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1IL-38及其受体IL-36RmRNA在CRC中的表达CRC组织中IL-38及其受体IL-36R mRNA的相对含量中位数分别为0.68和0.33，明显高于癌旁正常组织中的含量(0.23和0.07)。CRC组织与癌旁正常组织相比，差异有统计学意义(Z=-2.944、-3.254，P=0.003、0.001)。

2.2IL-38和IL-36RmRNA的表达与CRC临床特征的相关性IL-38和IL-36R mRNA在临床Ⅲ～Ⅳ期CRC组织中的相对含量明显高于临床Ⅰ～Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)。IL-38和IL-36R mRNA在淋巴结转移CRC组织中的相对含量明显高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)。IL-38和IL-36R mRNA在不同分化程度CRC组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 IL-38及其受体IL-36R mRNA表达与CRC临床特征的相关性Tab 1 Correlation of the clinical features of colorectal cancer and the expressions of IL-38 and its receptor IL-36R mRNA

2.3IL-38和IL-36RmRNA相关性分析对CRC组织中IL-38和IL-36R mRNA表达量进行相关性分析，结果显示，IL-38与IL-36R mRNA表达量呈正相关(r=0.63，P<0.001)。

3 讨论

多项研究表明，炎症反应参与CRC的发病，CRC围手术期应用肠道微生态制剂可减少肠道致病菌数量、降低术后炎症反应、抑制感染和降低并发症的发生率[9]。这一过程涉及多个细胞因子，例如IL-1[2-5]。IL-1包括IL-1α和IL-1β两个成员，过表达IL-1α和IL-1β均可促进CRC细胞增殖、侵袭、转移和肿瘤血管形成等[10-11]。外源性给予IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)可抑制CRC细胞增殖、侵袭，并提高抗肿瘤药物的输送能力[12]。新近发现的细胞因子IL-38属于IL-1家族成员，位于人类第2号染色体长臂1区4带1亚带，长约7.8 kb，包含5个外显子和4个内含子。IL-38在序列上与IL-1Ra和IL-36受体拮抗剂(IL-36Ra)高度同源，可能具有类似的生物学功能。由此推测，IL-38可能介导了CRC的病理学进程。

本研究采用实时荧光定量PCR技术检测62例CRC和对应癌旁正常组织中IL-38及其受体IL-36R mRNA的表达，发现CRC组织中IL-38和IL-36R mRNA均显著高表达，且在临床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴结转移的CRC患者中表达升高更为明显，提示IL-38和IL-36R参与CRC的病理进展，抑制IL-38和IL-36R的表达有望成为CRC新的治疗途径。此外，本研究还对IL-38和IL-36R mRNA的表达情况进行了相关性分析，结果发现两者呈高度正相关，表明IL-38通过与其受体IL-36R结合传递信号介导CRC的发生。该研究结果与TAKADA等[6]的报道一致。TAKADA等[6]研究检测了417例原发性肺腺癌中IL-38蛋白的表达，发现IL-38呈高表达，高表达IL-38的患者肿瘤体积更大、淋巴结转移更多、临床分期更晚、更易出现胸膜和血管侵袭、总生存期和无病生存期更短，且程序性细胞死亡配体1表达阳性。目前，IL-38介导CRC发病的分子机理尚不明确，推测可能影响了宿主免疫力和/或肿瘤微环境进而参与肿瘤的演变过程。

综上所述，本研究首次报道了CRC组织中IL-38及其受体IL-36R mRNA显著高表达，两者表达呈正相关，临床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴结转移患者中表达更高，提示IL-38通过与其受体IL-36R结合参与了CRC的发生、发展。未来有必要深入探讨其分子机制，为寻求CRC治疗新靶点奠定基础。