应用PCR-DGGE技术对不同地区储粮玉米霉菌的变化研究

张 华，岳晓禹

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院， 河南 郑州 450046 )

储粮玉米从收获入库到储藏的各个阶段都有可能被细菌、真菌、放线菌等微生物所污染，这些微生物在适宜生长的条件下会迅速生长繁殖，对储粮的品质与质量安全有着重要影响[1]。其中对储粮玉米危害最为严重的是霉菌及其代谢产物[2,3],它们不仅可以导致储粮玉米发生霉变，而且还可产生霉菌毒素。在玉米储藏过程中虽外表看不出有霉变，但已受霉菌毒素污染，食用也可引起人畜中毒[4]。产毒菌主要来源于曲霉菌属[5]、青霉菌属[6，7]、镰刀霉菌属[8]等。有关储粮玉米表面微生物真菌多样性的研究，多采用传统的分离培养的方法，如平板培养分离鉴定[9，10]，稀释涂布平板和biolog系统相结合[11]等，这些方法虽然能直观的反应真菌种属，但也存在较大的误差。在研究储粮表面微生物时，分子生物学技术如DGGE具有一定的优势，先提取储粮表面微生物的全基因组DNA，PCR技术扩增特定目的DNA片段，通过变性梯度凝胶电泳技术将碱基组成不同的DNA分离。本试验采用PCR-DGGE技术对河南、黑龙江地区粮库的储粮玉米进行霉菌菌群分析，为掌握储粮过程中霉菌变化规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 玉米样品的来源与存放

储藏玉米采集于黑龙江储藏粮库，时间为2013、2014、2015年，玉米品种为龙源288、龙育4号。河南储藏粮库中采集储藏玉米的时间为2013、2014、2015年，玉米品种为郑单958、浚单20、先玉335、伟科702。将上述玉米样品包裹完整后放于-80℃冰箱保存备用。

1.2 仪器与试剂

超声波振荡器(KQ-250B,中国上海早盈公司)；低温高速离心机(H1850R,湘仪离心机仪器有限公司)；聚合酶链式反应PCR扩增仪(2720型,美国Biometra公司)；变性梯度凝胶电泳仪(DCodeTMUniversalMutationDetectionSystemDGGE及凝胶成像分析系统Gel Doc XR，美国Bio-Rad公司)。N,N-亚甲基二丙烯酰胺(Bis)和丙烯酰胺(Acr)均购自美国Amresco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取储粮玉米表面真菌全基因组DNA(改良CTAB法)

各称取25g河南、黑龙江粮库不同年份的玉米，置于经高压灭菌过的锥形瓶中，加入40mLPBS磷酸盐缓冲液(灭菌)，放入超声波振荡器中振荡1 h。将其中的20 mL装入灭菌后的50mL离心管中，3000 r/min、4 ℃、离心5 min。收集上清液于50mL离心管中，8000 r/min、4℃，离心10min，沉淀得到菌体。采用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取储粮玉米表面真菌[12,13]，加入2mL 2% CTAB溶液，65℃预热30min，充分混匀，于65℃水浴1h，期间每10min混匀一次，取出冷却至室温。参照酚-氯仿-异戊醇的操作方法提取储粮玉米表面真菌全基因组DNA[14]。

1.3.2 目的片段真菌18S rRNA部分的PCR扩增

以提取的真菌基因组DNA为模板，通过DNAman软件筛选出Ns7F和Ns8R引物扩增真菌18S rRNA部分序列，PCR产物片段的大小为353 bp。带有GC夹的Ns7F引物：CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT AAC AGG TCT GTG ATG C和Ns8R引物：GCA GGT TCA CCT ACG GA。PCR反应体系： 25μL 2×Pfu Master Mix；1μL带有GC夹的Ns7F及1μLNs8R；1μL储粮玉米表面真菌全基因组DNA，0.2μL的Mg2+，ddH2O 21.8μL。扩增程序：94℃加热预变性5 min，94 ℃加热变性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4 ℃保存。1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.3.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和测序

采用Bio-Rad公司DCodeTM 型DGGE仪器，制备变性剂浓度从30%～ 60%的聚丙烯酰胺凝胶。电泳条件如下：60 ℃恒温、电泳缓冲液为1×TAE，先用120V电压将样本带出点样孔后，85V恒压电泳12 h。 待电泳结束后将凝胶取出放在溴化乙锭(EB)溶液中进行染色0.5 h。用Gel Doc XR+凝胶成像分析系统将染色后的凝胶进行拍照保存。将DGGE 图谱上的主要条带切胶回收，回收后的条带再使用不带GC夹的引物(Ns7F和Ns8R)进行PCR扩增，扩增后产物提交上海生工测序。测序得到的序列进行BLAST程序同源性比较，以百分数最高的比对结果作为该电泳条带的物种解释。

2 结果与分析

2.1 变性梯度凝胶电泳结果与相关分析

所测序列在NCBI上进行比对，相似性≥97%的序列则视为同一序列。结果如图1所示。

图1 不同地区粮库储藏玉米中霉菌群落的DGGE图谱

13A为河南地区2013年入库样品，14B为河南地区2014年入库样品，15C为河南地区2015年入库样品，13D为黑龙江地区13年入库样品，14E为黑龙江地区14年入库样品，15F为黑龙江地区15年入库样品。变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱中，条带的明亮程度相对该物种存在的丰富度高低[15]，从DGGE图谱可以看出：河南、黑龙江不同地区粮库中，储粮玉米样品表面霉菌群落差异明显。13D样品中霉菌群落条带较多，但亮度高的条带较少，这表明储粮玉米在贮藏过程中，由于粮库贮藏环境良好，霉菌菌落并不是优势菌群，这与粮库的温度、湿度成相关性。而14B和15C，14E和15F图谱中条带比较相似，表明霉菌菌落的分布与贮藏年限关系不大。

2.2 变性梯度凝胶电泳主要条带测序结果与分析

将如图1中的条带进行回收，用不加GC钳的Ns7F和Ns8R引物PCR扩增，并进行Sanger测序，将测序所得碱基序列通过BLAST程序在GenBank数据库中比对，结果如表1所示，可以看出无论是河南还是黑龙江粮库样品，亮度最高的条带为DGGE图谱中标注为2，物种注释是Zea mays clone 1686087 mRNA sequence，即来源于玉米自身的基因组序列，这可能是由于在提取玉米表面微生物过程中导致玉米细胞壁破损，释放出较多的玉米基因组DNA。从得到的霉菌种类上看，河南及黑龙江两地粮库中污染的霉菌有以下几种：产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)、斜卧青霉菌(Penicilliumdecumbens)及一株未鉴定到种的青霉物种(Penicilliumsp)，此外还发现了假灰绿曲霉(Aspergilluspseudoglaucus)和曲霉属真菌(Aspergillusneoflavipes)。同时还检测到有部分非霉菌的真菌物种，如Candida sp和Meyerozyma guilliermondii。

表1 碱基序列比对

3 讨论

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一[16]，它能够提供并分析样品群落中的优势种类信息并同时分析多个样品，同时具备可重复性和操作简单等特点，适合于研究微生物种群的多样性及时空变化，在食品微生物真菌多样性研究方面也逐渐采用这种方法[17,18]。与传统的分离培养的方法相比，如平板培养，biolog系统等，DGGE技术可以鉴定出粮食表面微生物无法利用传统方法分离出来的菌株，可快速分析大量样本，客观评价群落里特异的菌群。本实验发现储粮玉米主要的污染为青霉和曲霉，这与周玉庭等[18，19]报道中的结果相一致。结果表明，在储粮玉米贮藏过程中，霉菌菌落并不是优势菌群，这还与粮库的温度、湿度相关。