关于YES相关蛋白调控PTEN表达量的研究

孟甦 钱邦磊 余常麟

[摘要] 目的 探明YES相關蛋白（Yes-associated protein， YAP）如何通过调控miR-29a的表达来调节PTEN表达量。方法 ①以N2a细胞为研究对象，高表达及抑制YAP，测量其miR-29家族的表达量，并筛选出改变最明显的一个miRNA，并检测PTEN蛋白的表达;②通过改变miR-29a及YAP的蛋白水平，来检测YAP是通过何途径来调控PTEN蛋白的表达。结果 ①通过转染了过表达YAP质粒后，RT-PCR的结果显示miR-29家族中的3个成员miR-29a，miR-29b，miR-29c都明显上调了。其中miR-29a上调了明显。而同时抑制了YAP的细胞中，miR-29的表达量都明显下降。说明YAP与miR-29的表达量之间是一种正相关的联系。另外一方面，PTEN的表达量则正好与miR-29及YAP相反，在抑制了YAP后，PTEN的表达量呈现的上升趋势，而过表达了YAP后，PTEN则明显下降。这说明YAP与PTEN之间是一种负相关的联系。②无论YAP的量改变如何，起到决定性作用的仍然还是miR-29a。下游的PTEN受YAP及miR-29a调控，而其中miR-29a作为作用中枢又受到上游YAP的调控。这些证据都揭示了YAP对PTEN的调节作用是通过对miR-29a的调节来实现的。结论 该研究初步证实YAP能够通过对miR-29a的调控来实现对PTEN的表达，从而为治疗神经脊髓损伤提供研究基础。

[关键词] YAP;miR-29a;PTEN

[中图分类号] R329          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2018）09（a）-0021-03

Study on the Regulation of PTEN Expression by YES-related Proteins

MENG Su1， QIAN Bang-lei2， YU Chang-lin3

1.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， Jiangsu Province， 215000 China; 2.Department of Planning， Development and Performance Assessment， the Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， Jiangsu Province， 215000 China; 3.Department of Orthopedics， Changzhou Second People's Hospital， Changzhou， Jiangsu Province， 213164 China

[Abstract] Objective To explore how YES （Yes-associated protein） regulates the expression of PTEN by regulating the expression of miR-29a. Methods 1.N2a cells as the study object， high expression and inhibition of YAP， measuring the expression of the miR-29 family， and screening out the most obvious change in a miRNA， and detection of PTEN protein expression; 2.by changing the miR- Protein levels of 29a and YAP to detect the pathway by which YAP regulates PTEN protein expression. Results 1.RT-PCR showed that miR-29a， miR-29b and miR-29c were significantly up-regulated in the miR-29 family. Among them， miR-29a was significantly upregulated. In the cells that inhibited YAP at the same time， the expression of miR-29 decreased significantly. There was a positive correlation between the expression of YAP and miR-29. On the other hand， the expression level of PTEN was exactly the same as that of miR-29 and YAP. After inhibiting YAP， the expression level of PTEN showed an upward trend， while after overexpression of YAP， PTEN significantly decreased. This showed that there was a negative correlation between YAP and PTEN. 2.Regardless of how the YAP changes， the miR-29a still played a decisive role. Downstream PTEN was regulated by YAP and miR-29a， and miR-29a was centrally regulated by upstream YAP. These evidences had revealed that the regulation of PTEN by YAP was achieved through the regulation of miR-29a. Conclusion This study initially confirmed that YAP can achieve the expression of PTEN through the regulation of miR-29a， which provides a basis for the treatment of neuronal spinal cord injury.

[Key words] YAP; miR-29a; PTEN

最近的研究表明Hippo信號通路在调节动物器官与组织大小方面起到越来越重要的作用[1-2]。Yes相关蛋白作为哺乳动物Hippo通路最下游的效应器，它的磷酸化及抑制功能受到Hippo通路成分Lats因子的调节。

1  YAP上调了miR-29a的表达量并且下调了PTEN的表达

1.1  材料与方法

1.1.1  主要材料及仪器  小鼠来源神经瘤母细胞（购自上海中科院）。

1.1.2  实验方法  ①细胞培养及传代，RT-PCR（mRNA），Western Blot; ②过表达载体及干扰质粒的构建;③过表达载体合成于上海生工技术有限公司;④过表达质粒及干扰质粒转染N2a细胞。

1.2  结果

通过转染了过表达YAP质粒后，RT-PCR的结果显示miR-29家族中的3个成员miR-29a，miR-29b，miR-29c都明显上调了。其中miR-29a上调了最为明显。而同时抑制了YAP的细胞中，发现miR-29的表达量都明显下降。这说明YAP与miR-29的表达量之间是一种正相关的联系。如图1所示。

另外一方面，PTEN的表达量则正好与miR-29及YAP相反，在抑制了YAP后，PTEN的表达量呈现出明显的上升趋势，而过表达了YAP后，PTEN则明显下降。这说明YAP与PTEN之间是一种负相关的联系。如图2所示。

2  YAP对PTEN的调节作用是通过miR-29a来实现的

2.1  材料与方法

2.1.1  主要材料及仪器  YAP过表达N2a细胞，YAP低表达N2a细胞，正常N2a细胞。

2.1.2  实验方法  转染，Western-blot，PCR（同1.1.2）。

2.2  结果

为了研究YAP是直接调控PTEN，还是通过miR-29a来调控。在YAP KD的细胞中顺转了miR-29a mimic，同时在YAP OE的细胞中顺转了miR-29a inhibitor，通过蛋白表达分析，测出PTEN，p-AKT，AKT的表达量。在YAP OE的细胞系中，通过用miR-29a inhibitor抑制了miR-29a，然后发现PTEN的表达量明显升高，而p-AKT则是下降了，与此同时，AKT并无明显改变。而在YAP KD的细胞系中，miR-29a mimic则上调了miR-29a，PTEN的表达量是降低的，而p-AKT则上升了，同样的，AKT表达量并无明显改变。如图3所示。

3  讨论

在YAP过表达后处理后的细胞中，miR-29家族的表达是明显增加的，而其中miR-29a的表达量增加的最明显。而PTEN蛋白明显下降。从而揭示了YAP可以上调miR-29a，下调PTEN蛋白表达这一现象。为了确定YAP对PTEN的这种作用是否取决于miR-29a，该次采取了两步实验。鉴于PTEN蛋白在神经生长及分化方面的重要作用以及miR-29a与PTEN蛋白的关系做了一个蛋白分析和基因分析去测量PTEN的表达量。发现了YAP与PTEN之间的负相关联系。然后，又同时调节了miR-29a和YAP的表达量。在YAP 过表达细胞中下调miR-29a，在YAP 抑制细胞中上调miR-29a。通过测量miR-29a下游的基因PTEN。发现下调miR-29a能逆转YAP介导的PTEN的表达。不管YAP的改变如何，PTEN的表达取决于miR-29a的量。这些结果与miR-29a的改变是相同的。这说明，无论YAP的量改变如何，起到决定性作用的仍然还是miR-29a。为了进一步的研究发现miR-29a促进神经轴突生长是通过下调PTEN的表达及上调Akt的磷酸化。而该次的研究确实可以证明Yes相关蛋白能通过增加miR-29a的表达量来抑制PTEN蛋白。下游的PTEN受YAP及miR-29a调控，而其中miR-29a作为作用中枢又受到上游YAP的调控。这些证据都揭示了YAP对PTEN的调节作用是通过对miR-29a的调节来实现的。揭示了YAP是通过miR-29a来调控PTEN的表达。而PTEN蛋白（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）作为miR-29家族的一个作用靶点，是现在已知与神经细胞轴突生长息息相关的[6-8]。PTEN蛋白的抑制可以促进神经的生长与再生。从而为治疗神经脊髓损伤提供研究基础。

[参考文献]

[1]  Halder G ，Johnson RL. Hippo signaling： growth control and beyond[J]. Development， 2011， 138（1）： 9-22.

[2]  Yu FX， Zhao B ，Guan KL. Hippo Pathway in Organ Size Control， Tissue Homeostasis， and Cancer[J].Cell， 2015， 163（4）：811-828.

[3]  Hao Y， Chun A， Cheung K， et al. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP[J]. J Biol Chem， 2008， 283（9）：5496-5509.

[4]  Zhang J， Smolen GA，Haber DA. Negative regulation of YAP by LATS1 underscores evolutionary conservation of the Drosophila Hippo pathway[J].Cancer Res， 2008， 68（8）：2789-2794.

[5] Marti P， Stein C， Blumer T， et al.YAP promotes proliferation， chemoresistance， and angiogenesis in human cholangioc- arcinoma through TEAD transcription factors[J]. Hepatology， 2015，62（5）：1497-1510.

[6]  Kong G， Zhang J， Zhang S， et al. Upregulated microRNA-29a by hepatitis B virus X protein enhances hepatoma cell migration by targeting PTEN in cell culture model[J].PLoS One， 2011， 6（5）：e19518.

[7]  Lachyankar MB， Sultana N， Schonhoff CM， et al. A role for nuclear PTEN in neuronal differentiation[J].J Neurosci， 2000，20（4）：1404-1413.

[8]  Li B，Sun H. MiR-26a promotes neurite outgrowth by repressing PTEN expression[J]. Mol Med Rep， 2013， 8（2）：676-680.