大黄素对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠胰腺及肺组织Toll样受体4和9表达的影响*

蔡丹莉 高 凯,2 陈芝芸 石占利 徐 华 朱渊红 戴显微

1 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310018

2 宁波明州医院有限公司 浙江 宁波 315100

3 浙江省中西医结合医院 浙江 杭州 310003

重型急性胰腺炎(SAP)往往并发多器官功能不全，病死率高达30%［1］。临床和实验研究表明，过于强烈的炎症反应与SAP的发生发展及病死率密切相关［2］。Toll样受体(TLRs)与炎症反应密切相关［3］，急性肺损伤为SAP最先出现的胰外损伤，也是SAP早期死亡的主要原因。相关研究提示TLR4作为重要的信号分子与SAP的发病密切相关，但TLR4与SAP肺损伤的关系仍不明确。目前TLR9与SAP的研究主要基于病情已经发展到了一定程度，要阻止SAP的发展，应该首先从SAP发生早期找原因，而急性肺损伤就是SAP最早出现的并发症。大黄素（EMO）是生大黄的主要作用成分，课题组前期研究发现大黄素可以改善SAP大鼠胰腺及肺组织的炎症，可以促进肺组织炎症细胞凋亡［4］。为进一步探讨大黄素防治SAP肺损伤的作用机制，本研究观察其对胰腺及肺组织TLR4、TLR9等表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康成年雄性SD大鼠56只，体重180～220g，清洁级，由浙江省医学科学院提供。动物生产许可证：SCXK（浙）20080033。

1.2 实验药品和试剂：牛磺胆酸钠（ST），由美国Sigma-Aldrich公司提供，批号：BCBF3394V。实验前临时以生理盐水配置成3.5%的ST溶液。EMO（纯度＞98%），由上海融禾医药科技发展有限公司提供，批号：1071101108。实验前临用时以4%蔗糖脂肪酸酯配成4mg/ml的EMO混悬液。鼠抗TLR4单克隆抗体（批号GR55869-1）、鼠抗TLR9单克隆抗体（批号：GR4585-2）、鼠抗NF-κB/p65单克隆抗体（批号：GR51446-2）为英国Abcam公司产品。

1.3 实验方法：大鼠适应性饲养1周后随机分为3组，模型组、EMO组各24只及假手术组8只。除假手术组仅开腹轻微翻动胰腺即关腹外，其他2组采用开腹胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠的造模方法[4］建立SAP肺损伤模型；假手术组和模型组大鼠在术前、术后1h按10ml/kg体重腹腔注射4%蔗糖脂肪酸酯混悬液，EMO组在术前、术后1h按10ml/kg体重腹腔注射4mg/ml浓度的EMO混悬液，术后禁食不禁水，模型组和EMO组大鼠于手术造模后3h、6h、12h共3个时相点分批处理8只，假手术组在手术3h后处理；各处理大鼠麻醉下腹主动脉采血，分离胰腺和肺组织，部分组织经中性甲醛固定，脱水后常规石蜡包埋切片，免疫组化检测胰腺和肺组织TLR4、TLR9、核因子κB（NF-κB)蛋白表达，并根据胰腺和肺组织中阳性细胞的着色强度和范围进行半定量[5］。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡情况：假手术组未见死亡；模型组出现了不同程度的活动能力下降，3h、6h、12h时相点分别死亡3只、2只、2只；EMO组各时间点无死亡。

2.2 TLR4、TLR9、NF-κB蛋白在大鼠SAP肺损伤发生发展过程中表达变化：见图1。

图1 SAP大鼠胰腺和肺组织TLR4、TLR9、NF-κB蛋白表达的动态变化（±s）

2.3 EMO干预对SAP肺损伤大鼠胰腺及肺组织中TLR4、TLR9、NF-κB表达影响：见表1。

表1 EMO干预对SAP肺损伤大鼠胰腺和肺组织中TLR4、TLR9、NF-κB蛋白表达影响（±s）

表1 EMO干预对SAP肺损伤大鼠胰腺和肺组织中TLR4、TLR9、NF-κB蛋白表达影响（±s）

注：与同一时间点模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。

分组模型组3h EMO组3h模型组6h EMO组6h模型组12h EMO组12h胰腺组织肺组织只数NF-κB 2.10±0.22 2.25±0.53 2.67±0.26 3.31±0.46*3.17±0.61 2.46±0.47*5 8 6 8 6 8 TLR4 1.90±0.22 1.81±0.46 2.00±0.45 2.69±0.53*2.92±0.58 2.22±0.25**TLR9 2.35±0.42 2.38±0.35 2.17±0.41 2.88±0.35*3.08±0.58 2.43±0.42*NF-κB 2.60±0.22 2.69±0.26 2.83±0.41 3.34±0.32*3.75±0.42 2.88±0.64*TLR4 2.20±0.57 2.18±0.37 2.67±0.41 3.31±0.26**3.33±0.52 2.56±0.32*TLR9 2.30±0.76 2.18±0.70 2.25±0.69 2.75±0.27 3.25±0.52 2.56±0.50*

3 讨论

急性肺损伤是SAP最早出现的胰外并发症，是SAP早期的重要死亡原因，其发生于炎症反应有关。TLR4与TLR9均为TLRs的主要成员，前者主要识别病原微生物表面某些共有的特定分子结构；后者主要识别胞质中病毒双/单链RNA和胞质中细菌或病毒非甲基化cpG DNA，两者均可通过My D88依赖性途径的信号转导通路活化NF-κB，并调控肿瘤坏死因子-α、白介素-1β等炎症因子介导炎症反应。结合前期研究结果提示，SAP时胰腺和肺组织的TLR4、TLR9信号通路已被激活并发挥作用；同时，造模后可能首先启动胰腺组织的TLR4、TLR9信号通路，激活NF-κB造成胰腺组织的炎症反应；随疾病的进展，进一步启动肺组织的TLR4、TLR9信号通路，引起肺组织炎症和损伤。

大黄为常用中药，东汉张仲景《伤寒杂病论》中记载含有大黄的大承气汤[6]、大黄牡丹汤等经典方剂，在当今临床治疗SAP均取得不错疗效。EMO是大黄的一种主要成分。本研究发现，EMO能够降低SAP肺损伤模型大鼠的死亡率，随着时间的延长，EMO组大鼠胰腺及肺组织TLR4、TLR9、NF-κB的表达呈现先增加后下调的趋势，提示EMO抗SAP肺损伤的机制可能是通过抑制炎症相关分子的表达，阻断如TLR4和TLR9等炎症表达的信号分子，从而起到对抗炎症损伤，保护机体的作用。