基于高通量测序分析的荣成扇贝养殖区微型 浮游生物群落结构研究❋

乔 玲, 于 杰, 李 迎, 甄 毓❋ ❋, 米铁柱, 张玲玲, 5, 包振民, 5

(1.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；2.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100； 3.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266071； 4. 中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003； 5. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071)

基于高通量测序分析的荣成扇贝养殖区微型 浮游生物群落结构研究❋

乔 玲1, 2, 3, 于 杰4, 李 迎1, 2, 3, 甄 毓1, 2, 3❋ ❋, 米铁柱1, 2, 3, 张玲玲4, 5, 包振民4, 5

(1.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；2.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100； 3.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266071； 4. 中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003； 5. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071)

运用Illumina高通量测序技术对2011年7月荣成八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区中微型浮游生物群落组成特征进行研究，结果表明，在浮游植物种类组成上，2个样品中共检测到22个纲，其中海金藻、硅藻、绿藻、甲藻和隐藻是主要类群，多形微眼藻和抑食金球藻的18S rDNA相对丰度较高；在浮游动物种类组成上，2个样品中共检测到16个门，在八河扇贝养殖区18S rDNA相对丰度较高的浮游动物是软体动物、有孔虫和纤毛虫，而在楮岛扇贝养殖区则是环节动物的18S rDNA相对丰度较高。结果表明，荣成扇贝养殖区有暴发褐潮的可能，需采取有效措施进行应对。

抑食金球藻；多形微眼藻；18S rDNA基因；高通量测序

2009年6月，河北秦皇岛沿岸海域暴发了抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)褐潮，褐潮区从山海关延伸至抚宁，宽度约15 km，养殖的扇贝等出现滞长现象，严重时导致贝类死亡。2010年，褐潮影响面积扩大到3 350 km2，造成直接经济损失约2亿元[1]。2011年夏季，威海的桑沟湾和烟台的四十里湾也出现该种褐潮[2-3]。研究发现，抑食金球藻褐潮的暴发可能与海水养殖有关[4-5]。荣成市三面临海，水产资源十分丰富，是中国重要的水产养殖基地之一，主要养殖种类包括藻类、贝类、鱼类、海参等。2011年荣成市海水养殖总产量为61.9万t，比2010年增加了约1.2万t，养殖总面积约310 km2，总产值约90.6亿元[6]。随着海水养殖业规模的不断扩大，养殖面积和产量也大幅度提高，高密度的养殖使大量的有机物、营养盐类、抗生素、生长激素以及养殖生物的排泄物和代谢产物进入养殖水域，不可避免地对海洋环境造成污染和破坏[7-9]。对浮游生物而言，生境的改变可能会造成群落组成和结构的改变。

对浮游生物群落组成及多样性的检测方法有很多，包括显微镜计数、克隆文库技术、限制性片段长度多态性、变性梯度凝胶电泳、末端限制性片段长度多态性、实时荧光定量PCR技术、高通量测序技术等[5, 10-18]。其中，高通量测序技术因具有简单快速、成本低和测序通量高等优点，被广泛应用于宏基因组学、转录组学和基因组学等领域中[16, 19-21]，为浮游生物群落组成及多样性研究提供了新的方法。真核生物核糖体的18S rDNA基因序列上交替排列着保守区和可变区(V1～V9，没有V6区)[22]，保守区能体现生物物种间的亲缘关系[23]，而可变序列区则反映了物种间的差异，可用于鉴定不同物种。真核生物的8个可变区中，V9区变异性较高、长度较短且易于扩增和测序，可作为标记基因应用于浮游生物群落结构及多样性研究中[24-25]。Amaral-Zettler等设计了18S rDNA V9区的通用引物，利用454焦磷酸测序技术分析了海洋真核生物的群落结构及多样性，从而为研究海洋真核生物多样性开辟了新路[24]。

本研究选取真核生物18S rDNA可变区V9区作为标记基因，结合Illumina高通量测序与实时荧光定量PCR(qPCR)技术，对荣成八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区微型浮游生物的群落组成、多样性和丰度进行了调查和分析，以探讨扇贝养殖对微型浮游生物群落结构的影响，为发展扇贝的健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品于2011年7月14日采自荣成八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区，调查海区及站位如图1所示。取500 mL表层海水，经20 μm微孔滤膜过滤，去除悬浮颗粒物及较大的浮游生物，再用2 μm微孔滤膜过滤，收集海水中的微型浮游生物，将滤膜放入液氮保存，用于分析采样点微型浮游生物的群落组成及多样性。

图1 采样站位分布图Fig.1 Locations of the sampling stations

1.2 高通量测序

利用溴化十六烷基三甲胺(Cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取基因组DNA[26]，用通用引物V9F(5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC)和V9R(5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC)扩增18S rDNA可变区V9区[24]，PCR扩增体系和反应程序详见文献[27-28]。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化上述所得的PCR产物，用超微量分光光度计(GE Healthcare，美国)测定纯化后产物浓度，进行3’末端加A，反应体系详见文献[28]。72 ℃反应20 min后，利用MinElute PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，产物溶于13 μL洗脱缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl，pH=8.5)进行接头连接。反应体系及反应程序详见文献[28]。然后向PCR片段引入barcode序列，反应体系及PCR反应程序详见文献[28]。所得产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳条件为100 V、35 min。对目的片段用MinElute琼脂糖凝胶回收试剂盒(QIAGEN，德国)做胶回收纯化，纯化后的产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并用超微量分光光度计(GE Healthcare，美国)测定产物浓度。采用Illumina HiSeq 2000平台对文库进行PE100测序。

1.3 数据分析

1.3.1 数据拼接和质量控制 使用PANDAseq(http://github.com/neufeld/pandaseq/wiki/PANDAseq-Assembler)软件对测得的原始序列进行拼接，去掉引物序列，并对各序列进行质量筛选，去掉碱基质量值较低的序列，最终得到高质量序列。

1.3.2 OTU划分及代表序列的注释 使用Uparse(http://www.drive5.com/uparse)对获得的高质量序列在相似性为95%的水平上进行操作分类单元(OTU)的划分，把得到的OTUs代表序列与SILVA数据库(https://www.arb-silva.de/, Version 108)进行比对，得到每个OTU对应的物种分类信息，对代表序列的注释信息进行统计，分析该扇贝养殖区微型浮游生物的组成结构。

1.3.3 浮游生物群落分析 为比较样品间浮游生物多样性的差异，按照样品中序列数的最小值，对样品序列进行随机抽样，从而将不同样品的测序深度平等化[29]。

利用Qiime(http://qiime.org)软件计算样品的Alpha多样性指数，包括Chao I指数、shannon指数、Good’s覆盖率。Chao I指数用于表征群落的物种丰富度，Shannon指数用于衡量群落多样性，Good’s覆盖率用于评估测序深度。

1.4 环境样品中18S rDNA基因拷贝数的定量分析

以环境样品的基因组DNA为模板，用真核生物可变区V9区通用引物V9F(5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC)和V9R(5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC)进行PCR扩增[28]。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，对目的片段用DNA胶回收试剂盒(Takara，大连)纯化，然后进行连接、转化和培养。选取阳性克隆提取质粒，用超微量紫外分光光度计(Picodrop，英国)测定质粒标准品的浓度，计算得到质粒标准品中18S rDNA的拷贝浓度为4.67×1010copies/μL，对质粒标准品做10倍梯度稀释，用于质粒标准曲线的绘制。

以梯度稀释的质粒标准品为模板，用FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂盒进行qPCR。反应程序如下：50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、55℃ 40 s、72℃ 45 s，40个循环。以质粒拷贝数的对数值为横坐标，平均Ct值为纵坐标，绘制质粒标准曲线。

以2011年7月八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区的环境样品总DNA为模板，用上述反应程序，通过qPCR获得各样品中18S rDNA基因的Ct值，并通过质粒标准曲线计算各样品中浮游生物18S rDNA基因总拷贝数。各物种的18S rDNA基因拷贝数则通过计算各物种的18S rDNA相对丰度与18S rDNA基因总拷贝数的乘积得到，物种的18S rDNA相对丰度则是测序得到的该物种的序列数占总序列数的比例。

1.5 高通量测序序列登录号

将本研究测序得到的真核生物18S rDNA V9区基因核酸序列上传至NCBI高通量测序数据库Sequence Read Archive(SRA)，登录号为SRP093585。

2 结果

2.1 测序数据预处理

对八河和楮岛两个样品中微型浮游生物18S rDNA基因进行Illumina高通量测序，分别获得301 465和361 963条原始序列，通过质量过滤，分别得到262 219和313 131条高质量序列。经过随机取样将测序深度均一化之后，每个样品保留262 219条序列。在95%相似性水平上划分OTUs，共得到1 396个OTUs，且八河扇贝养殖区的OTUs数明显高于楮岛扇贝养殖区的OTUs数(见表1)。

表1 采样站位不同样品的原始序列数、高质量序列数和OTUs数Table 1 The raw reads, high quality reads and OTUs in different samples

把得到的OTUs代表序列与SILVA数据库(https://www.arb-silva.de/, Version 108)进行比对，注释得到每个OTU对应的物种分类信息。在1 396个OTU中，仅有806个OTU注释到真核生物界，其中注释到门、纲、属、种4个分类单元的OTU分别为397、229、182和127个，分别占OTU总数的28.44%、16.40%、13.04%和9.10%。一些18S rDNA相对丰度较高的OTU未能注释到纲，为全面分析浮游生物的群落组成和结构，将未注释到纲但18S rDNA相对丰度大于0.1%的物种的序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行比对，手工注释其分类信息。

2.2 浮游生物多样性分析

通过对八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区的微型浮游生物群落多样性进行分析，发现八河扇贝养殖区同时具有较高的Chao I指数和Shannon指数(见表2)，表明八河扇贝养殖区的微型浮游生物多样性高于楮岛扇贝养殖区；2个采样点的Good’s覆盖率均高于99.9%，且随着序列数的增加，稀释曲线趋于平稳(见图2)，说明现有的测序深度足以反映样品中绝大多数微型浮游生物信息。

表2 采样站位微型浮游生物群落多样性指数Table 2 The diversity index for nanoplankton community in different samples

图2 采样站位各样品的稀释曲线Fig.2 Rarefaction curve of each sample

2.3 浮游生物群落组成

八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区的微型浮游生物组成情况如图3所示，在八河扇贝养殖区，浮游植物、浮游动物和真菌分别占总浮游生物的68.53%、15.38%和0.50%；在楮岛扇贝养殖区，浮游植物、浮游动物和真菌则分别占总浮游生物的80.01%、0.70%和0.01%，浮游植物18S rDNA相对丰度较高的是楮岛扇贝养殖区，而浮游动物18S rDNA相对丰度较高的则是八河扇贝养殖区。

图3 采样站位微型浮游生物18S rDNA相对丰度Fig.3 Relative abundance of 18S rDNA from nanoplankton in different samples

微型浮游植物在纲分类水平上的群落组成情况如图4a所示。2个样品中共检测到22个纲，海金藻纲(Pelagophyceae)、中型硅藻纲(Mediophyceae)、圆筛藻纲(Coscinodiscophyceae)、甲藻纲(Dinophyceae)、Mamiellophyceae、 隐藻纲(Cryptophyceae)、 共球藻纲(Trebouxiophyceae)、真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)定鞭藻纲(Haptophyceae)、金藻纲(Chrysophyceae)是18S rDNA相对丰度较高的10个纲。在八河扇贝养殖区，硅藻是主要类群，约占总浮游生物的39.04%，其次是海金藻、绿藻、甲藻和隐藻，分别占总浮游生物的19.66%、4.05%、3.30%和1.16%；在楮岛扇贝养殖区，海金藻是主要类群，约占总浮游生物的73.07%，其次是隐藻、绿藻和硅藻，分别占总浮游生物的1.91%、1.84%和1.49%。

微型浮游动物在门分类水平上的群落组成情况如图4b所示。2个样品中共检测到15个门，软体动物门(Mollusca)、有孔虫门(Foraminifera)、纤毛虫门(Ciliophora)、环节动物门(Annelida)和丝足虫门(Cercozoa)是18S rDNA相对丰度较高的5个门。在八河扇贝养殖区，18S rDNA相对丰度最高的浮游动物是软体动物，其次是有孔虫和纤毛虫，分别占总浮游生物的11.25%、2.32%和1.02%；而在楮岛扇贝养殖区，18S rDNA相对丰度最高的则是环节动物，其次是丝足虫和纤毛虫，分别占总浮游生物的0.37%、0.14%和0.11%。

(A.微型浮游植物在纲分类水平上的18S rDNA相对丰度；b.微型浮游动物在门分类水平上的18S rDNA相对丰度。a. Nanophytoplankton at class level; b.Nanozooplankton at phylum level.)

图4 采样站位微型浮游生物的18S rDNA相对丰度
Fig.4 Relative abundance of 18S rDNA from nanoplankton in different samples

为更直观的体现不同站位群落组成的差异性和相似性，构建韦恩图(见图5)。八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区中浮游生物共分为1 396个OTUs，其中2个养殖区共有物种549个，约占总浮游生物的39.3%。共有物种中，18S rDNA相对丰度较高的浮游植物是抑食金球藻(A.anophagefferens)、多形微眼藻(Minutocelluspolymorphus)、假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)，分别占总浮游生物的46.33%、12.40%和2.34%。

2.4 浮游生物18S rDNA基因拷贝浓度的定量分析

以质粒拷贝浓度的对数值为横坐标，qPCR的Ct值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=-3.225x+38.5，其中R2=0.9953，扩增效率为104.2%。

八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区中浮游生物总18S rDNA基因拷贝浓度分别为3.59×105和8.62×104copies/mL。18S rDNA相对丰度大于1%的浮游生物类群主要有海金藻(Pelagophytes)、硅藻(Diatoms)、甲藻(Dinoflagellates)、绿藻(Chlorophytes)、隐藻(Cryptophytes)、软体动物(Mollusca)、有孔虫(Foraminifera)和纤毛虫(Ciliophora)，其18S rDNA基因拷贝浓度如图6所示。在八河扇贝养殖区，硅藻的18S rDNA拷贝浓度最高，为1.40×105copies/mL，其次是海金藻和软体动物，其浓度分别为7.06×104和4.04×104copies/mL；在楮岛扇贝养殖区，则是海金藻的18S rDNA拷贝浓度最高，为6.30×104copies/mL，其次是隐藻和绿藻，其浓度分别为1.66×103和1.58×103copies/mL。

图5 采样站位样品中OTUs分布韦恩图Fig.5 Venn diagram showing the unique and shared OTUs in samples

图6 18S rDNA相对丰度大于1%的微型 浮游生物的18S rDNA基因拷贝浓度

3 讨论

浮游植物是海洋生态系统中重要的初级生产者和能量转换者，其种类和数量的改变会引起海洋食物链发生变化，对浮游动物和鱼虾等海洋生物的生长产生重大影响，甚至导致整个海洋生态系统的结构和功能发生改变；浮游动物在海洋食物网中起着承上启下的作用，既可以作为消费者捕食浮游植物，又是上一级消费者(如鱼、虾等)的重要饵料，是食物链的重要组成部分。浮游生物群落的多样性对其生存的海洋生态系统结构和功能的稳定起着非常重要的作用。在本研究中，运用Illumina高通量测序技术，对威海荣成临近海域八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区的微型浮游生物群落组成进行调查，结果显示，在浮游植物种类组成上，2个样品中共检测到22个纲，其中海金藻、硅藻、绿藻、甲藻和隐藻是主要类群(见图4a)，海金藻抑食金球藻和硅藻多形微眼藻是18S rDNA相对丰度较高的物种(见图5)；在浮游动物种类组成上，两个样品中共检测到16个门，在八河扇贝养殖区18S rDNA相对丰度较高的浮游动物是软体动物、有孔虫和纤毛虫，而在楮岛扇贝养殖区则是环节动物的18S rDNA相对丰度较高(见图4b)。与显微镜观察计数相比，高通量测序技术在浮游生物群落组成与多样性研究方面，节约了大量人力、物力，不会遗漏一些个体较小或丰度较低的物种，为快速、准确、全面地分析浮游生物群落组成提供了高效可行的检测方法。

八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区的浮游生物群落结构有较大差异。浮游植物方面，在八河扇贝养殖区，18S rDNA相对丰度最高的是硅藻，约为39.04%，其次是海金藻、绿藻、甲藻和隐藻；而在楮岛扇贝养殖区，18S rDNA相对丰度最高的则是海金藻，约为73.07%，其次是隐藻、绿藻和硅藻。浮游动物方面，在八河扇贝养殖区，18S rDNA相对丰度最高的是软体动物，其次是有孔虫和纤毛虫；而在楮岛扇贝养殖区，18S rDNA相对丰度最高的则是环节动物，其次是丝足虫和纤毛虫。八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区的浮游生物群落结构存在较大差异的原因可能与当地海域的环境条件如温度、盐度及营养盐条件有关。一方面，扇贝养殖会使水体中的有机营养物质含量增加，养殖密度及养殖规模的不同会导致两个区域的有机营养物质含量存在差异。另一方面，2011年7月荣成共有12场降雨，平均两天一场，荣成最大的水库——八河水库在6月26日首次开闸泄洪以来，7月份又有3次泄洪，八河水库在泄洪时将淡水排入桑沟湾，八河扇贝养殖区中有机营养盐和无机营养盐的浓度因淡水的输入均会降低；桑沟湾楮岛沿岸有大叶藻海草床分布，大叶藻生长过程中吸收利用环境中的无机营养盐，影响楮岛扇贝养殖区无机营养盐含量，因此，两个区域的营养盐含量及组成可能存在差异，进而导致两个海域中浮游植物群落结构不同，浮游植物群落结构的不同又会通过影响浮游动物摄食而改变其群落结构。

在八河扇贝养殖区，硅藻的18S rDNA拷贝浓度最高，达到1.40×105copies/mL，其中，多形微眼藻为8.46×104copies/mL，约占硅藻总拷贝数的60.44%，其次是抑食金球藻，约为7.06×104copies/mL；在楮岛扇贝养殖区，则抑食金球藻的18S rDNA拷贝浓度最高，约为6.30×104copies/mL，其次是多形微眼藻，约为1.07×103copies/mL。于杰等通过对2011年渤海海域褐潮期微型浮游生物多样性研究发现，褐潮可能是由抑食金球藻和多形微眼藻两种浮游植物共同形成的[27]。Qiao等通过研究2013年秦皇岛海域褐潮暴发过程中优势种的时空动态变化，同样发现抑食金球藻可以与多形微眼藻共存[4]。

抑食金球藻的18S rDNA拷贝浓度之所以较高，一方面与其营养盐利用特性有关。大量研究表明，抑食金球藻可以吸收利用溶解性有机物中的碳、氮、磷[30]。通过现场监测发现，抑食金球藻褐潮暴发时，海水中溶解有机氮(Dissolved organic nitrogen, DON)含量会随着抑食金球藻细胞密度的增加而降低[31]，且与未暴发抑食金球藻褐潮的海域相比，暴发该种褐潮的海域中DON浓度较高[32-33]。Dong等通过转录组测序分析发现，抑食金球藻在硝酸盐和尿素同时作为氮源的培养条件下，主要吸收利用尿素，而不是硝酸盐[34]。楮岛周边水产养殖较为发达，养殖密集，滤食性贝类的代谢产物不能被微生物及时分解利用，从而使养殖水体中的有机营养物质含量增加；另外，滤食性贝类的生物沉降使养殖海区底部滞留丰富的有机营养物质，这些有机物经微生物矿化作用和再悬浮后再次进入水体营养盐循环[35]，这就为抑食金球藻褐潮的暴发提供了营养支持。此外，密集的海水养殖使水体中的颗粒物含量增加，导致水体透明度下降，进而影响光的透射率。研究发现，与自养藻类相比，抑食金球藻更能适应低光照环境[36]，一方面可能是因为该藻能够直接利用溶解有机碳中的碳元素[37]，另一方面，与其它竞争藻类相比，抑食金球藻含有更多与捕获光相关的基因[38]。因此，抑食金球藻这种可以高效利用有机营养盐以及适应低光照的能力使其比其他自养藻类更具有竞争优势。

抑食金球藻的18S rDNA拷贝浓度较高的另一个原因可能与其摄食压有关。有研究表明，滤食性双壳类可以通过下行控制作用对浮游植物产生影响，进而改变水体中浮游植物群落结构[39-40]。抑食金球藻个体微小，直径约为2 μm[41]，与这类较小的微微型浮游生物(直径小于3 μm)相比，较大的微型浮游生物更容易被双壳类摄食[40]。Gobler等的研究发现在褐潮暴发过程中，小型浮游动物更喜欢摄食其他浮游植物而不是抑食金球藻[42]。此外，抑食金球藻细胞外的胞外多糖层也会抑制贝类摄食[43-44]。因此，摄食压的降低促进了抑食金球藻褐潮暴发。

多形微眼藻细胞直径约为2.5～3.5 μm[45]，实验室研究发现，多形微眼藻能降低海湾扇贝幼体的生长率和成体的产卵率[45]，导致贻贝的清除率降低[46]。多形微眼藻与抑食金球藻细胞大小相近，都能抑制海湾扇贝的生长，与褐潮暴发过程中观察到的海湾扇贝幼虫的滞长现象一致。Smayda和Villareal在纳拉甘西特湾褐潮研究中同样发现这两种藻可大量共存[47]。为研究抑食金球藻与多形微眼藻之间的竞争作用，将二者的培养液按不同比例(1%～99%)混合，结果发现抑食金球藻对多形微眼藻的生长并没有明显的抑制作用[48]，这可能是抑食金球藻褐潮暴发时多形微眼藻能与之共存的原因之一。另外，两种藻的营养盐利用特性也有差异，以谷氨酸和尿素为唯一氮源分别对2种微藻进行培养，结果发现抑食金球藻对谷氨酸和尿素的吸收利用能力要高于多形微眼藻[49]。目前，有关多形微眼藻的营养盐利用情况，可供参考的文献资料较少，该方面还有待进一步研究。

综上所述，荣成扇贝养殖区18S rDNA相对丰度较高的物种是抑食金球藻和多形微眼藻。抑食金球藻18S rDNA的拷贝浓度较高，表明该养殖区有暴发褐潮的可能。因此，为保证荣成海域扇贝养殖的可持续发展，应当采取有效措施预防褐潮暴发。一方面，需要提高养殖技术并加强对养殖环境的管理，如合理确定养殖面积与养殖密度，改进投饵方式，减少残饵量，提高水体循环与自净能力等；另一方面，建立贝藻混养综合生态养殖模式，利用海带、江蓠、龙须菜、孔石莼等大型海藻吸收和去除扇贝排泄的氮、磷，控制水体富营养化，改善扇贝养殖海区的水体环境质量；此外，还要加强对养殖海区的监测力度，特别对个体微小的多形微眼藻、抑食金球藻建立高效有效的检测方法(如定量PCR、抗体检测技术等)。通过对养殖海区进行长期监测，建立养殖海域浮游生物种质数据库，构建褐潮预警预报模型，制定应急预案，以保障海水养殖健康发展。

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CharacteristicsofEukaryoticNanoplanktonCommunityintheScallopCultureAreaofRongchengbyIlluminaSequencing

QIAO Ling1, 2, 3, YU Jie4, LI Ying1, 2, 3, ZHEN Yu1, 2, 3, MI Tie-Zhu1, 2, 3, ZHANG Ling-Ling4, 5, BAO Zhen-Min4, 5

(1. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 4. Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China; 5. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

Plankton community structures in samples collected from the scallop culture area of Bahe and Chudao in July, 2011 were analyzed using Illumina sequencing. The results showed that 22 classes of phytoplankton (Pelagophyceae, Mediophyceae, Coscinodiscophyceae, Dinophyceae, Mamiellophyceae, Cryptophyceae, Trebouxiophyceae, Haptophyceae, Chrysophyceae, Bolidophyceae, Ulvophyceae, Chlorophyceae, Raphidophyceae, Synurophyceae, Nephroselmidophyceae, Katablepharidaceae, Dictyochophyceae, Eustigmatophyceae, Bacillariophyceae, Chlorodendrophyceae, Florideophyceae and Prasinophyceae) and 16 phyla of zooplankton (Mollusca, Foraminifera, Ciliophora, Euglenozoa, Annelida, Cercozoa, Chordata, Cnidaria, Amoebozoa, Porifera, Apicomplexa, Arthropoda, Bryozoa, Apusozoa, Entoprocta and Nemertea) were detected in the scallop culture area of Bahe and Chudao. For phytoplankton,pelagophytes, diatoms, chlorophytes,dinoflagellates and cryptophytes were the main groups. For zooplankton, Mollusca, Foraminifera and Ciliophora were dominant in Bahe scallop culture area;however,the relative abundance of 18S rDNA from Annelida was higher than others in Chudao scallop culture area. In the scallop culture area of Bahe, the 18S rDNA copy concentration of diatoms was highest, andMinutocelluspolymorphusaccounted for 60.44% of diatoms.Aureococcusanophagefferenswas the second dominant phytoplankton. In the scallop culture area of Chudao, the 18S rDNA copy concentration ofA.anophagefferenswas highest, followed byM.polymorphus.M.polymorphusandA.anophagefferenswere dominant species in the scallop culture area of Rongcheng. The results indicated that there was the possibility of brown tides breaking out in the scallop culture area of Rongcheng.Some effective measures should be taken to prevent the outbreak of brown tides.

Aureococcusanophagefferens;Minutocelluspolymorphus; 18S rDNA gene; high-throughput sequencing

Q178.53

A

1672-5174(2018)02-064-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20160399

乔玲， 于杰， 李迎， 等. 基于高通量测序分析的荣成扇贝养殖区微型浮游生物群落结构研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版)，2018, 48(2): 64-72.

QIAO Ling, YU Jie, LI Ying, et al. Characteristics of eukaryotic nanoplankton community in the scallop culture area of Rongcheng by Illumina sequencing[J]. Periodical of Ocean University of China, 2018, 48(2): 64-72.

海洋公益性行业科研专项(201205031)；国家自然科学基金项目(41521064)；青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2016ASKJ02)资助

Supported by the Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201205031); the National Natural Science Foundation of China (41521064); the Scientific and Technological Innovation Project of the Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2016ASKJ02)

2016-12-14；

2017-02-09

乔玲(1991-)，女，博士生，研究方向为褐潮暴发过程中营养盐特征及浮游植物群落结构研究。E-mail：qiaoling1990123@126.com

❋ ❋ 通讯作者：E-mail：zhenyu@ouc.edu.cn

责任编辑 高 蓓